一种离体状态的模拟皮肤模型制造技术

本发明专利技术为设计一种离体状态的模拟皮肤模型，利用细胞培养小室与孔板作为离体皮肤模型“骨架”，将永生化表皮细胞细胞培养小室中，成纤维细胞接种于下室孔板中，进行共培养。本发明专利技术方法可有效模拟人体皮肤基本构造，并有效的用于化妆品及药用化合物透皮吸收及促进成纤维细胞增殖、迁移功能的评价，可以很好的取代传统动物实验及离体皮肤组织实验，不仅可有效降低实验成本、提高实验通量及效率，而且可以很好的满足日益重视的科研伦理要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药及化妆品领域，是离体状态的模拟皮肤模型的设计和美容应用。
技术介绍
皮肤位于人体的表面，是直接与外界环境接触的人体最大的器官。主要分为表皮、真皮、皮下组织、皮肤附属器四个部分。表皮又分为角质层、透明层、颗粒层等；角质层是表皮的最外层，由4～8层扁平无核的角化死细胞紧密排列而成。角质层的厚薄是影响皮肤对营养物质、美容因子吸收的重要决定因素。真皮位于表皮之下，与表皮呈波浪状牢固相连，其厚度约为表皮的10倍。由大量纤维结缔组织(胶原纤维、弹力纤维、网状纤维)、细胞(成纤维细胞、组织细胞)和基质(黏多糖、蛋白质和盐分)构成，这三部分的缺失均会导致皮肤的弹性下降、呈现干燥、起皱纹等缺水状态。同时，真皮还富有血管、淋巴管、神经、腺体、立毛肌等。其中，成纤维细胞是真皮层最重要的细胞之一。对于许多化妆品原料及外用药用化合物而言，透皮吸收效率低下是制约其功效的最重要原因。例如，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)具有极强地促进细胞增殖的能力，可作为化妆品添加剂及药物发挥皮肤修复、调养及去痘(去除粉刺、痊疮和青春痘)、美白等功效。然而，作为一种生物大分子，透皮吸收差一直是困扰其实际应用的重大问题。研究表明，EGF以0.5μg/g的剂量涂抹12h后累积透皮率也仅有0.993％，证明绝大部分的EGF未能透过皮肤，在作为外用药(如美容药物等)或添加到化妆品中时，其透皮吸收效果十分微弱。因此，简便、高效、灵敏、可靠的透皮吸收能力评价模型，对于化妆品及外用药用化合物的高通量筛选与评价具有重要的意义。然而，利用动物模型评价化妆品功效一直备受诟病。英国早在1986年就通过了《实验动物保护法案》(Animals(ScientificProcedures)Act,1986(ASPA))，禁止进行化妆品成品和原料的动物实验。欧盟也在2003年发布了“化妆品行业禁止动物实验”的禁令，明确规定“2009年3月11日，禁止销售成分和成品进行了动物实验的化妆品，但重复毒性、生殖毒性以及毒代毒理学的实验例外；2013年3月11日，全面禁止动物实验，包括重复毒性、生殖毒性以及毒代毒理学实验。”目前，世界上已经明确禁止化妆品动物实验的国家和地区有欧盟、英国、巴西、挪威、土耳其、韩国、印度、新西兰、以色列等。正在讨论禁止化妆品动物实验的国家和地区则包括美国、俄罗斯、澳大利亚、加拿大、阿根廷、中国台湾等。因此，建立非动物实验的化妆品评价模型具有十分重要且紧迫的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建一种离体状态的模拟皮肤模型，为生物美容产品和生物药物透皮吸收能力的高效评价及潜在化合物的高通量筛选提供一种新方法。本专利技术实现目的的技术方案如下：一种离体状态的模拟皮肤模型，利用细胞培养小室与孔板作为离体皮肤模型“骨架”，将表皮细胞与成纤维细胞进行共培养，以模拟皮肤组织构造状态。而且，所述细胞培养小室为可架置于细胞培养孔板中、底边为孔径0-4μm微孔膜的小室。而且，所述细胞培养小室为Transwell或Thincert。而且，所述孔板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板。而且，所述表皮细胞包括人永生化细胞系以及分离的原代表皮细胞。而且，所述成纤维细胞包括永生化细胞系以及分离的原代成纤维细胞。而且，所述表皮细胞为Hacat，所述成纤维细为Balb/c3T3。离体状态的模拟皮肤模型用于对样品透皮吸收能力及其促进成纤维细胞增殖、迁移功能的评价的应用。一种离体模拟皮肤模型在美容产品及生物药物原料透皮吸收及功效评价中的应用。本专利技术的有益效果和优点是：1、本专利技术构建了一种不依赖于活体动物或动物组织的离体状态下的模拟皮肤模型，可作为化妆品及外用药传统动物实验或皮肤组织实验的替代评价模型。2、本专利技术可有效实现对样品透皮吸收能力与生物活性的评价，且实验周期短、操作简便、灵敏度高、成本低廉。3、本专利技术构建了一种不依赖于活体动物或动物组织的离体状态下的模拟皮肤模型，可有效实现对样品透皮吸收能力与生物活性的评价，且实验周期短、操作简便、灵敏度高、成本低廉，为化妆品及外用药的透皮吸收能力的评价与化合物高通量筛选提供了一种新的可替代传统动物实验或皮肤组织实验的评价模型与方法。附图说明图1为离体皮肤模拟模型构建示意图，1、Transwellinsert；2、细胞培养板；3、Hacat细胞；4、培养液；5、Balb/c3T3细胞。图2为利用离体皮肤模拟模型进行重组蛋白的生物学活性检测。图3为利用离体皮肤模拟模型进行蛋白跨膜转运及透皮吸收能力的检测。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术设计一种离体状态的模拟皮肤模型，可用于对样品透皮吸收能力与生物活性的评价，具体内容包括：利用底边孔径0-4μm微孔膜的细胞培养小室与对应孔板作为离体皮肤模型“骨架”，将Hacat等永生化细胞系或分离的原代表皮细胞与Balb/c3T3等永生化细胞系或分离的原代成纤维细胞进行共培养，以模拟皮肤组织构造状态。将样品添加到上室中处理一定时间后，通过检测下室中样品浓度以及成纤维细胞增殖与迁移情况。一、离体模拟皮肤模型的构建⑴成纤维细胞(以Balb/c3T3细胞为例)用含10％胎牛血清的完全培养液DMEM于37℃、5％CO2条件下培养。表皮细胞(以Hacat为例)用含15％胎牛血清的完全培养液MEM于37℃、5％CO2条件下培养；⑵上述细胞培养至一定密度消化各取150μl、500μl接种于细胞培养小室(以0.4μm孔径Transwell为例)的上室和下室中，培养24h(在培养第12h时，弃掉上室细胞培养基，使用含有0.4％DMEM培养基进行饥饿培养)使之成为单层细胞(图1)。二、离体模拟皮肤模型对样品透皮吸收及促进成纤维细胞增殖与迁移能力的评价⑴在离体模拟皮肤模型构建好后。然后将样品(以EGF标准品及融合细胞穿膜肽的EGF，即PEM，为例)用无血清培养基梯度稀释，使EGF标品终浓度为20μg/ml，pME终浓度分别为10μg/ml、20μg/ml，更换上下室细胞的培养基，继续培养60h。⑵利用免疫荧光技术对上下室细胞的蛋白定位进行分析，以确定样品的透皮吸收能力(图2)；⑶用MTT方法对下室细胞的增殖情况进行检测，以确定样品对成纤维细胞增殖能力的影响(图3)；若同时分析样品对成纤维细胞迁移能力的影响，则可在模型构建之处，用无菌移液器洗头在下层细胞划一条线以产生划痕，加样处理后不同时间，于倒置显微镜下检测划痕愈合情况。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体状态的模拟皮肤模型，其特征在于：利用细胞培养小室与孔板作为离体皮肤模型“骨架”，将表皮细胞与成纤维细胞进行共培养，以模拟皮肤组织构造状态。

【技术特征摘要】
1.一种离体状态的模拟皮肤模型，其特征在于：利用细胞培养小室与孔板作为离体皮肤模型“骨架”，将表皮细胞与成纤维细胞进行共培养，以模拟皮肤组织构造状态。2.根据权利要求1所述的离体模拟皮肤模型，其特征在于：所述细胞培养小室为可架置于细胞培养孔板中、底边为孔径0-4μm微孔膜的小室。3.根据权利要求1或2所述的离体模拟皮肤模型，其特征在于：所述细胞培养小室为Transwell或Thincert。4.根据权利要求1所述的离体模拟皮肤模型，其特征在于：所述孔板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学刚，王玥，闫莉华，张同存，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12