海鞘素743的代谢物制造技术

完成了由人细胞色素ＣＹＰ３Ａ４代谢的几种Ｅｔ７４３代谢产物的纯化和结构说明。本专利中这些化合物缩写为ＥＴＭ，紧接着标注数字，数字表示该化合物的近似分子量。迄今为止三个化合物已经鉴定，分别命名为ＥＴＭ３０５，ＥＴＭ７７５和ＥＴＭ２０４。这些代谢物的结构如ＥＴＭ３０５，ＥＴＭ２０４和ＥＴＭ７７５所示。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1999年5月11日，申请号为200510054418.1专利技术名称为“海鞘素743的代谢物”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术的背景海鞘素(ecteinascidin本专利技术缩写为Et或Et′s)是从海洋被囊动物Ecteinascidia turbinata分离出来的具有很强抗肿瘤作用的药物。特别是，Et′s729，743和722已证明具有值得开发的体内抗肿瘤作用，包括对P388鼠白血病，B16黑素瘤，Lewis肺癌以及几种人肿瘤外移植物的小鼠模型的抗肿瘤作用。美国专利号5,089,273中讲述天然的Et743的分离和特性，在此引入作为参考。美国专利号5,721,362中讲述合成的Et743的制备，在此引入作为参考。海鞘素化合物，特别是Et′s729的抗肿瘤作用，在科学文献得到充分证明。例如，见Goldwasser等，美国肿瘤研究协会会报(Proceeding of American for Cancer Research)39598(1998)；Kuffel等，美国肿瘤研究协会会报(Proceeding of American forCancer Research)38596(1997)；Moore等，美国肿瘤研究协会会报(Proceeding of American for Cancer Research)38314(1997)；Mirsalis等，美国肿瘤研究协会会报(Proceeding of American forCancer Research)38309(1997)；Reid等，肿瘤化疗和药理学(Cancer Chemotherapy and pharmacology)38329-334(1996)；Faircloth等，欧洲肿瘤杂志(European Journal ofCancer)，32A，Supp.1，pp.S5(1996)；Eckhardt等，美国肿瘤研究协会会报(Proceeding of American for Cancer Research)37409(1996)；Henddriks等，美国肿瘤研究协会会报(Proceedingof American for Cancer Research)37389(1996)；以上文献报道的公开内容在此引入作为参考。海鞘素743(Et743)具有下面的结构 鉴于这类化合物的令人注目的抗肿瘤作用，寻找可能具有相等或更高抗肿瘤作用的相关结构的化合物的研究一直在继续。致力于Et743的天然代谢物分离和特性研究的本专利技术就是这些连续研究的结果。本专利技术概述完成了由人细胞色素CYP3A4代谢的几种Et743代谢产物的纯化和结构说明。本专利中这些化合物缩写为ETM，紧接着标注数字，数字表示该化合物的近似分子量。例如，ETM305和ETM775是由西班牙PhamaMar公司分析化学部所进行的生化研究中所获得的代谢混合物中分离出来的。由MayoClinic公司进行的类似代谢研究促成了ETM204的鉴定。这些海鞘素代谢物的结构如下 图的简要说明通过参考后面的图以及这个说明，可以更好理解本专利技术，其中附图说明图1是在CDCI3中ETM-SiOH-1(非极性不纯物)的1H NMR波谱图(500MHz)；图2是ETM-SiOH-4(ETM775)的HPLC色谱图；图3是ETM-SiOH-3(ETM305)的HPLC色谱图；图4是ETM-SiOH-2(痕量代谢物)的HPLC色谱图；图5是在M.B.(magic bullet)中ETM305的LRFAB质谱图；图6是ETM305的ESI质谱图；图7是在CD3OD中ETM305的1H NMR波谱图(750MHz)；图8是ETM305的FAB/MS/MS谱图；图9是ETM305的紫外光谱图；图10是ETM的紫外光谱图；图11是在M.B.(magic bullet)中ETM775的LRFAB质谱图；图12是ETM775的ESI质谱图(正性模型)；图13是ETM775的ESI质谱图(负性模型)；图14是ETM775的FAB/MS/MS谱图(M/Z1 38-302)；图15是ETM775的FAB/MS/MS谱图(M/Z 440-620)；图16是在CD3OD中ETM775的1H NMR波谱图(750MHz)；图17是ETM775的紫外光谱图；图18是ETM305的HPLC色谱图；图19是ETM305的紫外光谱图；图20是ETM305的ESI质谱图；图21是ETM204的ESI质谱图；图22是在CD3OD中ETM204的1H NMR波谱图(500MHz)；以及图23是ETM204的ESI/MS/MS谱图。本专利技术的详细说明I.Et743的代谢研究A.代谢混合物ETM的制备将Et743(50μM)与配制在含NADPH生成系统(0.4mMNADP+，25mM6-磷酸葡萄糖，0.5U/ml6-磷酸葡萄糖脱氢酶和3.3mM氯化镁)的0.1Mtris-HCI缓冲液中的浓度为0.4mg/ml的人成淋巴细胞表达的CYP3A4同种型一起孵育。在37℃孵育4小时后，加入冰冷乙腈中止反应，离心(12000g，4min)弃去固状物，上清液作HPLC分析。B.ETM305和ETM775的纯化2.6mg ETM(按前面A中方法制备)溶于少量CHCI3中，加到硅胶柱(8×100mm玻璃柱，填充硅胶/CHCI3浆)。硅胶柱先用CHCI3洗脱，接着用CHCI3/MeOH混合液(98，96，94，92和90％)洗脱。共收集10个试管(每管3ml)，并根据簿板色谱(TLC)结果作合并处理，产生四个级分(表1)。如1H NMR谱图(图1)所示，极性较小和非细胞毒级分(ETM-SiOH-1，2mg)由结构上与Et743不相关的脂组成。剩下的细胞毒级分用HPLC(PhenomenexUtracarb，ODS，10um，10×150mm，3∶1MeOH/H2O0.02M NaCI，1ml/min，Da检测210，220，254和280nm)作进一步纯化。极性最大的级分(ETM-SiOH-4，0.2mg)产生0.1mg ETM775(图2)。ETM-SiOH-3产生0.3mg ETM305(图3)。ETM-SiOH-2由几种微量代谢物组成(图4)。表1.ETM-SiOH级分Rf，重量和细胞毒性 a硅胶TLC采用CHCI3/MeOH作为流动相。b在250ng/mg浓度下的生长抑止率为30％。C.ETM305的结构用HRFAB/MS分析显示ETM305(对L1210细胞株的IC50为0.2ug/ml)一分子离子峰在306.0977处(图5)。该数据与其分子式C15H16NO6(Δ0.1mmu)一致。ESI/MS分析证实了ETM305的该分子量(图6)；在m/z306处观察到分子离子与其钠加合物在一起。ETM305的1HNMR波谱图(图7)对于确定其结构是非常重要的。在δ2.04，2.28和6.09处的共振现象分别与Et743中Me-6(δ 2.03)，-OCOCH3(δ2.29)和二氧-甲叉质子δ6.11，δ6.01)几乎相同。此外，还观察到与一个-CH＝CH-NHCHO单位(δ7.09，d，1H，J＝15Hz；δ6.19，d，1H，J＝15Hz；本文档来自技高网...

【技术保护点】
基本上纯化的，具有如下结构的ＥＴＭ２０４：＊＊＊ＥＴＭ２０４。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：KL莱恩哈特，JJ莫拉勒斯，J赖德，I雷孟多，P弗洛里亚诺，L加西亚格拉瓦洛斯，
申请(专利权)人：法马马有限公司，
类型：发明
国别省市：ES[西班牙]