玻璃海鞘粗提物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，步骤如下：（1）玻璃海鞘粉碎并匀浆；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，收集上清液；（3）将上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；（6）4℃静置过夜；（7）移除丙酮上清液，沉淀离心，转速10000rpm，时间20min，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，除去丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液离心，转速10000rpm，时间20min，取上清备用；（10）上清液用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的活性组份。本发明专利技术的方法可以简单、快速地提取到玻璃海鞘的粗提物，粗提物中的成分全面且提取率高。

Method for preparing crude extract of sea squirt

The invention relates to a method for preparing glass from crude extract comprises the following steps: (1) the Ciona crushed and homogenized; (2) the homogenate at 4 DEG C, 10000rpm centrifugal 20min, supernatant was collected; (3) the supernatant is heated to 70 DEG C, incubated with 30min; (4) the supernatant from heart, speed 10000rpm, time 20min, the supernatant was collected; (5) was treated with acetone three times the volume of the crude extract of Ciona, become 70% in acetone, purified; (6) 4 C standing overnight; (7) to remove acetone supernatant, centrifugal precipitation, speed 10000rpm, time 20min leave, precipitation standby; (8) precipitation into kitchen ventilation, remove acetone; (9) it was dissolved in ultra pure water, the solution was centrifuged, speed 10000rpm, time 20min, Torikami Kiyo spare; (10) by using the 5KDa ultrafiltration membrane Retention of active components greater than 5KDa was retained. The method of the invention can extract the crude extract of the glass sea squirt simply and quickly, and the components in the crude extract are comprehensive and the extraction rate is high.

【技术实现步骤摘要】
玻璃海鞘粗提物的制备方法
本专利技术属于海洋生物
，具体涉及玻璃海鞘粗提物的制备方法。
技术介绍
从海洋生物中提取分离活性物质是海洋药物研究的重要方向之一，而其中抗肿瘤活性研究是一大热点，海洋生物中含有多达数万种活性多肽，且许多是陆生生物中所不具有的，海洋生物多肽的潜在应用价值使得各国科学家争相进行实验研究。近年来，国内外相关研究表明，海洋生物中含有大量的具有抗肿瘤活性的多肽和蛋白，已经得到的包括海绵多肽，海葵多肽，海兔多肽，芋螺多肽。但关于玻璃海鞘抗肿瘤活性蛋白的分离和活性研究还未见报道。玻璃海鞘（CionaintestinalisL.）地方名：海茄子，海鼻涕。其形态特征是：体透明，柔软，体长55毫米～70毫米。顶端具2个不同的孔，位高者为入水孔周围有8个裂瓣；位低者为出水孔，有6个裂瓣，每个裂瓣顶端有1红色斑点。幼体白色，成体淡黄色。个体背腹伸长，被囊非常柔软、半透明。产地、季节：主要分布于我国的黄海、渤海海域，为我国北方优势物种。繁殖期是5-11月，盛产期为8-10月。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种玻璃海鞘粗提物的制备方法。一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于-80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液备用，弃沉淀；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；整个过程丙酮应缓慢加入，边加入边搅拌，防止局部丙酮浓度过大，引起蛋白过度沉淀；（6）4℃静置过夜；（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液。沉淀用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min,弃上清，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，12小时左右尽量除去沉淀中残留的丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，弃沉淀，取上清备用；（10）上清液通过milipore公司的超滤仪，用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，将活性组份置于-20℃保存。本专利技术的方法可以简单、快速地提取到玻璃海鞘的粗提物，粗提物中的成分全面且提取率高。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于-80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液备用，弃沉淀；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；整个过程丙酮应缓慢加入，边加入边搅拌，防止局部丙酮浓度过大，引起蛋白过度沉淀；（6）4℃静置过夜；（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液；沉淀用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min,弃上清，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，12小时左右尽量除去沉淀中残留的丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，弃沉淀，取上清备用；（10）上清液通过milipore公司的超滤仪，用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，将活性组份置于-20℃保存。玻璃海鞘经清洗、粉碎、过滤、丙酮沉淀、重溶、超滤，分别收集分子量小于5kDa和大于5kDa组分，经过BEL-7402肝癌细胞进行细胞毒测定（MTT实验），发现大于5kDa组分表现出强的抗肿瘤细胞活性，并呈剂量依赖关系。当粗提物浓度达到2mg/ml，培养时间48小时对肿瘤细胞的抑制率达到50%左右。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于‑80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液备用，弃沉淀；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；整个过程丙酮应缓慢加入，边加入边搅拌，防止局部丙酮浓度过大，引起蛋白过度沉淀；（6）4℃静置过夜；（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液；沉淀用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min,弃上清，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，12小时左右尽量除去沉淀中残留的丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，弃沉淀，取上清备用；（10）上清液通过milipore公司的超滤仪，用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，将活性组份置于‑20℃保存。...

【技术特征摘要】
1.一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于-80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液备用，弃沉淀；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚方强，
申请(专利权)人：青岛清泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37