一种海鞘多肽及其制备方法技术

本发明专利技术海鞘多肽及其制备方法属于生化与生物医药领域。本发明专利技术海鞘多肽具有式（Ⅰ）所示序列，分子量是６６６．３。其制备方法首先用乙醇常温浸泡减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用有机溶剂萃取，浓缩；依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　ＬＨ２０色谱法分离提纯得到，其中硅胶色谱法用ＣＨＣｌ↓［３］∶ＭｅＯＨ∶Ｈ↓［２］Ｏ比为７∶３∶０．５的洗脱剂梯度洗脱，收集薄层色谱紫外光检识Ｒ↓［ｆ］为０．２～０．３的洗脱液浓缩。本发明专利技术海鞘多肽具有抗ＨＢＶ作用，本发明专利技术海鞘多肽制备方法具有提取方法工艺简单，设备投资少，生产过程便于控制，原料来源广泛等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化与生物医药领域，具体涉及海鞘多肽及其制备方法。
技术介绍
海鞘(Ascidia)是尾索动物亚门(Uronordata)纲的尾索动物，从海鞘中提取的抗癌成分已有少数进入临床或临床前阶段。研究发现海鞘类生物计含有生物碱类、肽类、吲哚类、重金属螯合剂、多硫化物、大环内酯、萜类等数十种化合物，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、诱导肌浆网释钙、抑制钙调蛋白活性等多种生理活性，尤其以对抗肿瘤的研究报道较多(李志军，薛长湖，王长海.海鞘中的抗肿瘤生物活性物质.海洋通报，2004，23(5)82-86；季宇彬，池文杰.海鞘中抗肿瘤活性物质的研究.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2005，21(1)6-10.)。中国专利CN03111710.4提及从海鞘中提取具有抑制血小板聚集和抗凝血作用的海鞘脂肪酸，中国专利CN01812043.1提及从海鞘中提取具有抗肿瘤和抗病毒活性作用的海鞘素，中国专利CN03807576.8提及海鞘素及其制备方法。目前海鞘类的专利申请在海鞘素和脂肪酸等方面有报道，而从海鞘中提取海鞘多肽的制备方法及其在治疗乙肝中的应用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽。本专利技术另一目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽的制备方法。本专利技术所述的海鞘多肽用下序列式表示Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala(1)，式中Ser是丝氨酸，Leu是亮氨酸，Lys是赖氨酸，Ala是丙氨酸。本专利技术所述的式(1)表示的海鞘多肽，是浅黄色针状结晶，茚三酮反应阳性，分子量为666.3。本专利技术所述的海鞘多肽制备方法，含有以下步骤首先用乙醇浸泡海鞘，回收乙醇得到浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取得到海鞘粗提物；最后使用色谱法分离提纯得到。本专利技术海鞘多肽制备方法中海鞘粗提物制备方法是，用海鞘等重量的70～90％(体积浓度v/v)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取，浓缩水溶液得到海鞘粗提物。本专利技术所述水的用量为浸膏2～3倍。其中所述倍数是指水的体积(ml)是浸膏质量(g)的倍数。本专利技术所述有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷其中一种或两种以上。本专利技术所述的有机溶剂较好是二氯甲烷或氯仿其中一种，最好是氯仿。本专利技术所述的萃取次数为2～4次。本专利技术每次萃取所用有机溶剂用量和水的用量比为体积比1∶1。本专利技术所述色谱法可以是大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法其中一种或两种以上。本专利技术所述色谱分离提纯方法最好是依次采用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法。本专利技术所述的大孔树脂色谱法是本领域常用的大孔树脂色谱方法。其具体步骤为海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥。本专利技术所述的大孔树脂最好是非极性大孔树脂。本专利技术所述的大孔树脂是非极性或弱极性聚苯乙烯大孔树脂，例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300等。本专利技术所述的大孔树脂最好是D-101大孔吸附树脂。本专利技术所述的硅胶柱色谱方法，是本领域常用的硅胶色谱方法。本领域技术人员可以依据本领域知识得到最佳的参数。本专利技术硅胶色谱方法具体步骤为将海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl3: MeOH∶H2O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf为0.2～0.3的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。本专利技术所述的Sephadex LH20色谱法，具体步骤为将海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2mi/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf约为0.23的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。本专利技术所述的Sephadex LH20为羟丙基葡聚糖凝胶。本专利技术所述的海鞘(Ascidian)可以是尾索动物亚门(Uronordata)海鞘纲的尾索动物皱瘤海鞘。本专利技术所述的海鞘多肽制备方法，还可以对海鞘进行预处理，具体步骤是将新鲜海鞘清洗、沥干、干燥、粉碎；干燥温度低于80度；干燥包括风干、烘干、真空干燥等。本专利技术所述的海鞘多肽的制备方法最好是，首先将海鞘用等重量的70～90％(体积浓度)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏2～3倍的水溶解，然后用和水用量相同(体积)的氯仿萃取2～4次，浓缩得到海鞘粗提物；将海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥得到海鞘多肽粗提取物；将上述海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl3: MeOH∶H2O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf为0.2-0.3的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽粗提取；将上述海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱后，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识Rf约为0.23的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽。本专利技术海鞘多肽有抗HBV作用。为了更好的理解本专利技术，下面用本专利技术的相关药理试验及结果来说明其用途。本专利技术所述的抗HBV细胞实验的方法用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，按3×104细胞/孔分种于96孔板，2天后换用含药培养液，每个浓度加4孔。样品用细胞培养液分别稀释成16、8、4mg/ml 3个浓度，与细胞作用12天后，吸取细胞上清液，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg滴度。余下细胞用MTT法测定药物的细胞毒性。实验以拉米呋定作为阳性对照药物，以未加任何药物的细胞作为细胞对照组。1.1ELISA法测HBsAg、HBeAg1.1.1每孔加入待测标本50μl，设阴性、阳性对照各2孔，并设空白对照1孔。1.1.2每孔加入酶结合物50μl(除空白对照外)，充分混匀后封板，置37℃孵育8小时。1.1.3手工洗板弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干。1.1.4每孔加入显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；1.1.5每孔加入终止液50μl，混匀；1.1.6用酶标仪测定。取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值，阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按照实际OD计算。1.2MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度向细胞中加入400μg/ml MTT液0.1ml/孔，37℃5％CO2孵育4h，可见黄黑色甲瓒颗粒，弃去MTT液，加入100％DMSO 0.1ml/孔，待甲瓒颗粒完全溶解(约10min)后，用紫外分光光度计于波长570nm处测定吸光度A值，以4孔未加细胞的100％DMSO为空白对照。1.3实验结果的计算。半数抑制浓度(IC50)是HBsAg或HBeAg抑制率为50％时的药物浓度，半数毒性浓度(TC50)是实验孔存活细胞为细胞对照孔50％时的浓度。 海鞘多肽的抗HBV效果如表1所示，海鞘多肽对细胞的毒性作用如表2所示。根据计算，本专利技术所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海鞘多肽，其特征在于具有如下序列：Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ，式中Ｓｅｒ是丝氨酸，Ｌｅｕ是亮氨酸，Ｌｙｓ是赖氨酸，Ａｌａ是丙氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万新祥，胡文军，曾凡林，王瑞，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]