UPLC-MS/MS法测定人血浆和尿液中绿原酸的浓度制造技术

本文涉及UPLC-MS/MS法测定人血浆和尿液中绿原酸的浓度。本发明专利技术提供了通过超高效液相色谱串联质谱法测定人体液中绿原酸的浓度的方法，其中所述方法采用流动相0.5％甲酸水∶乙腈进行。本发明专利技术方法的单个样品的分析时间为2min，绿原酸在血浆5～2,000ng/mL以及尿液50～20,000ng/mL范围内线性关系良好，日内、日间精密度(RSD)均小于15％。本研究方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证。本发明专利技术的方法已经成功应用于给予绿原酸注射液治疗患者的血浆及尿液中绿原酸的浓度检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测人体液中绿原酸的浓度的方法。具体而言，本专利技术涉及通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人体液中绿原酸的浓度的方法。
技术介绍
引言绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的缩酚酸，在食用和药用植物如金银花、杜仲、向日葵中有较广泛的研究。大量的研究已经证明绿原酸具有抗炎、抗菌和抗病毒活动等广泛的生物功能[1-4]。最近的研究显示绿原酸能够诱导人类肝癌细胞、神经胶质瘤细胞以及白血病细胞的凋亡[5-8]。众所周知，癌症是世界范围的一个主要公共卫生问题，随着近年来癌症患者的数量继续增加，绿原酸因具有抗癌活性和低毒性不断成为人们关注的焦点。绿原酸作为生物反应调节剂免疫原性低(即不良反应少)，通过激活机体自身的免疫系统，使机体自身有针对性的产生特异性免疫效应，实现机体免疫平衡，可根据病变部位的免疫缺失，稳定而适度地补充和表达内源性免疫效应分子，修正肿瘤微环境的免疫失衡，从而更好地发挥对肿瘤治疗的作用，具有重要的临床价值。作为具有临床应用前景的化合物，其治疗晚期恶性肿瘤的I期临床药代动力学研究正在进行中。一些采用液相色谱串联质谱(liquidchromatography-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS)技术测定生物样品中绿原酸的方法均有报道[9-11]。到目前为止，只有一篇测定了人血浆中绿原酸的浓度，且单个样品的检测时间为5min[11]，并且没有测定在人尿液中绿原酸浓度的方法学报道。超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)色谱运用小颗粒(小于2μm)增加效能，从而增加仪器的解析度。UPLC具有高分离度、高速度、高灵敏度的优点，提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。然而，UPLC对流动相，色谱柱，样品前处理，质谱接口，数据采集系统都提出了更严格的要求。尽管对转换方法进行了一些研究，传统的高效液相色谱HPLC的条件不能直接应用于UPLC，需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择等各项条件进行大量试验，才能与这种小颗粒填料相匹配，实现UPLC快速检测分析。例如，周新等人的研究(HPLC与UPLC色谱条件转换方法研究，分析试验室，第27卷第4期，2008年4月)表明直接将HPLC条件应用于UPLC，不能达到对待测物质分离分析的目的；需要对实验条件包括例如流动相选择和配比等进行充分试验才能获得分离状况良好的UPLC方法。
技术实现思路
专利技术人已经建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱(ultrahighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS)技术检测人血浆和尿液中绿原酸的浓度。单个样品的检测时间可达到2min。在一些实施方案中，本专利技术的方法可以采用葛根素为内标进行。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。在一些实施方案中，专利技术人已经显示葛根素的基质效应与绿原酸一致，能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。在一些实施方案中，本专利技术的方法可以采用ACQUITYUPLCShieldRP18column(100mm×2.1mm，1.7μm)作为分析柱进行。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。在本专利技术中，专利技术人发现嵌有亲水性氨基甲酸基团的AcquityBEHShieldRP18colum(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters)能够实现绿原酸良好分离和峰型，而其它色谱柱如AcquityUPLCC18柱(50mm×2.1mm，1.7μm，Waters)进行实验时绿原酸呈现双峰，因此不适合使用。在一些实施方案中，本专利技术的方法可以采用流动相甲酸水∶乙腈进行。在一些实施方案中，流动相的体积比为0.5％甲酸水∶乙腈(85/15，v/v)-0.5％甲酸水∶乙腈(50/50，v/v)，包括0.5％甲酸水∶乙腈(80/20，v/v)-0.5％甲酸水∶乙腈(60/40，v/v)，优选的例如采用0.5％甲酸水∶乙腈(77/23，v/v)进行。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性，向流动相中加入改性剂等。在一些实施方案中，本专利技术的方法用于检测人血浆中绿原酸的浓度。在本专利技术的用于检测人血浆中绿原酸浓度的方法中，已经发现通过蛋白沉淀法如甲醇和乙腈蛋白沉淀处理血浆样品，存在明显的基质抑制效应，尽管这可以通过添加甲酸而降低，基质效应仍然导致同一样品信号极不稳定。基质指的是样品中被分析物以外的组分，其常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，例如，溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响，这些影响和干扰被称为基质效应。在一些实施方案中，本专利技术的方法采用液液萃取进行样品处理。在一些实施方案中，本专利技术的方法采用乙酸乙酯的液液萃取，优选的进一步加入盐酸进行分析。已经发现，在本专利技术的萃取方法中加入盐酸可以提高回收率。在一些实施方案中，本专利技术的方法进一步采用甲酸甲醇水进行复溶，优选的采用0.5％甲酸水∶甲醇(30/70，v/v)-0.5％甲酸水∶甲醇(70/30，v/v)，包括0.5％甲酸水∶甲醇(40/60，v/v)-0.5％甲酸水∶甲醇(60/40，v/v)，优选的例如采用0.5％甲酸水∶甲醇(50/50，v/v)进行。已经发现仅采用甲醇水稀释时，基质抑制效应较大，而改用甲酸甲醇水稀释时可以显著改善基质效应。在一些实施方案中，本专利技术用于检测人尿液中绿原酸的浓度。在一些实施方案中，本专利技术的方法直接稀释法处理尿液样品，而不必进行其它预处理。当采用甲醇水稀释时，可观察到40-50％的基质抑制效应，改用甲酸甲醇水稀释时，基质效应明显改善。在一些实施方案中，本专利技术的方法采用甲酸甲醇水进行稀释，优选的采用0.5％甲酸水∶甲醇(30/70，v/v)-0.5％甲酸水∶甲醇(70/30，v/v)，包括0.5％甲酸水∶甲醇(40/60，v/v)-0.5％甲酸∶水甲醇(60/40，v/v)，优选的例如采用0.5％甲酸水∶甲醇(50/50，v/v)进行。已经发现仅采用甲醇水稀释时，基质抑制效应较大，而改用甲酸甲醇水本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定人体液中绿原酸的浓度的方法，其中所述方法采用流动相甲酸∶甲醇进行。

【技术特征摘要】
1.通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人体液中绿原酸的浓度的方法，
其中所述方法采用流动相甲酸∶甲醇进行。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法采用的0.5％甲酸水∶乙腈流动相的体积比为
0.5％甲酸水∶乙腈(85/15，v/v)-0.5％甲酸水∶乙腈(50/50，v/v)，优选0.5％甲酸水∶乙腈
(77/23，v/v)。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用ACQUITYUPLCShieldRP18column
(100mm×2.1mm，1.7μm)作为分析柱进行。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法采用葛根素为内标进行。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述体液为人血浆或尿液。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法通过等梯度洗脱进行。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述体液为人血...

【专利技术属性】
技术研发人员：石远凯，韩晓红，李宁，宋媛媛，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11