本发明专利技术公开了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针及其制备方法和应用，其中以香豆酰肼和2,6-吡啶二甲醛为原料合成了一种香豆素类席夫碱衍生物(化合物1)，化合物1在与铜离子配位后形成了席夫碱结构的香豆素类-铜离子配合物,即为(化合物1-Cu2+)。该探针由于Cu2+的顺磁性及螯合作用的影响，使化合物1荧光淬灭。当加入巯基氨基酸后，化合物1-Cu2+荧光增强。而其它非巯基氨基酸几乎不影响。紫外可见光谱吸收和荧光光谱表明化合物1-Cu2+在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中对含有巯基的氨基酸具有良好的选择性和灵敏性。本发明专利技术成功用于人子宫颈鳞癌细胞中，进行了检测谷胱甘肽的细胞成像实验。有望用于生物体内硫醇化合物的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用探针技术，具体涉及一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
巯基(-SH)是细胞中化学活性很高的基团。生物体中存在许多蛋白质和非蛋白质巯基化合物，如还原型谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(CYS)等，它们具有重要的生理功能。而这些硫醇水平的异常与许多疾病有关。谷胱甘肽是细胞内含量最丰富的硫醇，作为机体内重要的生物活性巯基化合物，谷胱甘肽在维持生物体内正常氧化还原反应、细胞信号的转导、基因调控等方面发挥着至关重要的作用。更重要的是，还原型谷胱甘肽能够清除体内的有害毒物和代谢产物，维持细胞膜的完整性，减少自由基对DNA的攻击，从而减少DNA的损伤和突变。谷胱甘肽还参与高铁血红蛋白的还原作用，及促进铁的吸收等。细胞内谷胱甘肽的浓度(1～10mM)远远高于细胞外水平(2uM)。人体许多疾病的产生都与谷胱甘肽的缺乏有关，如：肝损伤、癌症、艾滋病、神经退行性疾病等。因此，快捷、方便、准确、灵敏地测定生物体内的谷胱甘肽含量，始终备受人们的高度重视。在各种分析方法中，荧光检测由于其简单、方便、成本低、灵敏度高和其潜在的细胞内成像等特性，已被证明是一种非常实用的检测方法。目前，许多有机反应已被用于硫醇荧光探针的合成，如醛和氨基之间的环化反应、迈克尔加成反应、2,4-二硝基苯与硫醇的裂解反应、亲和取代反应、二硫化物交换反应、Cu2+络合物脱金属反应等。一种方法是基于chemodosimetric反应的分子探针，但这种方法需要较长的孵育时间，通常为20分钟到1个小时甚至更长时间，实用性较低。另一种方法是利用Cu2+与-SH的高亲和力来设计荧光探针。这种反应大多发生在1毫秒之内，因此，预计可用于临床检测。由于硫醇与Cu2+的特异性亲和力，使其探针有较高的灵敏度，同时也提高了此方法用于各种荧光探针设计的可能性。香豆素是荧光成像探针使用最广泛的荧光基团之一。由于它们较强的荧光强度、优良的溶解性、高效的细胞渗透性和易于制备等优点，使其成为非常有吸引力的原始荧光材料。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针及其制备方法和应用，新的荧光探针化合物1-Cu2+。作为前体的化合物1是化合物2(香豆酰肼)和2，6-吡啶二甲醛化合而成。化合物1与Cu2+配位，制备成化合物1-Cu2+。化合物1有较强的荧光，而化合物1-Cu2+几乎没有荧光。当加入含巯基氨基酸后，化合物1-Cu2+的荧光恢复，而加入不含巯基的氨基酸后，化合物1-Cu2+的荧光强度几乎没有改变。因此，化合物1-Cu2+可用于检测硫醇，例如：如谷胱甘肽。甚至可应用于细胞成像中。本专利技术的技术方案是：一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的制备方法，化合物2即香豆酰肼和2，6-吡啶二甲醛化合制得化合物1即香豆素类席夫碱衍生物，化合物1与Cu2+配位，制备成硫醇荧光探针即化合物1-Cu2+。本专利技术的进一步改进包括：将0.3028g的化合物2(1.1mmol)溶于最少量的乙醇中，加入0.0676g的2,6-吡啶二甲醛(0.5mmol)；氮气保护下，加热回流12小时；冷却后有沉淀析出，得到的纯净物即为化合物1。本专利技术的另一目的在于提供一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针，按照上述的方法制得。本专利技术还提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的应用，具体是在检测巯基氨基酸中的应用。所述的应用，具体是在检测谷胱甘肽中的应用。所述的应用，具体是用于生物体内硫醇化合物的检测。本专利技术进一步提供了一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的应用，在活细胞中谷胱甘肽成像中的应用。所述的应用，具体是在人子宫颈鳞癌细胞中成像的应用。本专利技术用香豆酰肼和2,6-吡啶二甲醛合成了一种新的化合物1，当化合物1与Cu2+配位后，制备出硫醇荧光探针，即化合物1-Cu2+。荧光光谱测试表明：在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，该探针对硫醇具有很好的选择性和灵敏性，尤其是对GSH。除此之外，探针还具有良好的细胞膜渗透性和低的细胞毒性，可用于活细胞中GSH成像，将有望用于临床上GSH的检测。附图说明图1是在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，随着Cu2+的加入，化合物1(10μmol/L)的紫外光谱。嵌入图：在440nm处，化合物1的紫外可见滴定光谱。图2是在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，随着Cu2+的加入，化合物1(10μmol/L)的荧光光谱。嵌入图：在485nm处，化合物1的荧光滴定光谱(激发：440nm)。图3是在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，随着GSH的加入，化合物1-Cu2+(10μmol/L)的荧光响应。嵌入图：在485nm处，化合物1-Cu2+的荧光滴定光谱(激发：440nm)。图4是化合物1-Cu2+(10μmol/L)对不同氨基酸的荧光响应强度(发射：485nm)。第一栏代表加入不同氨基酸后的荧光强度；第二栏代表同时加入GSH和非巯基氨基酸后的荧光强度。图5a是在SiHa细胞中，化合物1的荧光成像。图5b是在SiHa细胞中，化合物1-Cu2+的荧光成像。图5c是在SiHa细胞中，化合物1-Cu2++GSH的荧光成像。图5d是在SiHa细胞中，化合物1的明场。图5e是在SiHa细胞中，化合物1-Cu2+的明场。图5f是在SiHa细胞中，化合物1-Cu2++GSH的明场。图6是化合物1的氢谱。图7是化合物1的碳谱。图8是化合物1的质谱。图9是化合物1(10μmol/L)在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，对各种金属离子的紫外可见吸收光谱。图10是化合物1(10μmol/L)在CH3CN:HEPES(3:2,v/v)溶液中，对各种金属离子的荧光光谱响应。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做详细说明。实施例1试剂4-二乙基氨基水杨醛，丙二酸二乙酯，哌啶，80％水合肼，2，6-吡啶二甲醛，各种金属离子的高氯酸盐(Cr3+,Ag+,Fe3+,K+,Na+,Mg2+,Pb2+,Ca2+,Hg2+,Mn2+,Cd2+,Fe2+,Zn2+,Ni2+,Co2+,Cu2+)的水溶液(2.0×10-2M)，各种氨基酸的水溶液(2.0×10-2M)，无水乙醇，乙腈(色谱纯)，二甲基甲酰胺(分析纯)，HEPES(pH:7.35-7.45)溶液等。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2即香豆酰肼和2，6‑吡啶二甲醛化合制得化合物1即香豆素类席夫碱衍生物，化合物1与Cu2+配位，制备成硫醇荧光探针即化合物1‑Cu2+。
【技术特征摘要】
1.一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2
即香豆酰肼和2，6-吡啶二甲醛化合制得化合物1即香豆素类席夫碱衍生物，化合物1与
Cu2+配位，制备成硫醇荧光探针即化合物1-Cu2+。
2.根据权利要求1所述的一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针的制备方法，
其特征在于，将0.3028g的化合物2(1.1mmol)溶于最少量的乙醇中，加入0.0676g
的2,6-吡啶二甲醛(0.5mmol)；氮气保护下，加热回流12小时；冷却后有沉淀析出，得
到的纯净物即为化合物1。
3.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：何广杰，王中权，李静，薛爱荣，张伟，毛光兰，何广彦，李超英，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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