铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法技术

技术编号:14557851 阅读:130 留言:0更新日期:2017-02-05 12:17
本申请提供了铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法,利用铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶与琥珀酰辅酶A合成酶的偶联反应产生的无机磷酸与钼酸铵孔雀绿染料的显色反应来检测该类酶的酶活。此外,本申请还提供了双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及其应用。

Enzyme activity detection system and method for iron and alpha keto acid dependent monooxygenase

This application provides a detection method for iron and alpha ketoglutarate dependent dioxygenase enzyme, chromogenic reaction coupling reaction produced by iron and ketoglutarate dependent dioxygenase and succinyl coenzyme A synthase of inorganic phosphate and ammonium molybdate to detect the malachite green dye enzyme live. In addition, the enzyme activity detection system, kit and application thereof are also provided.

【技术实现步骤摘要】

本申请属于生物技术检测领域,具体涉及双加氧酶活性的通用检测方法,更具体地,涉及所有以α-酮戊二酸和铁离子作为辅助因子的双加氧酶(即铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶)活性的通用检测方法。
技术介绍
双加氧酶,是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化酶的总称。铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶[α-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases(α-ODDs)]属于广泛分布于自然界中的非血红素铁蛋白,是一种参与多种氧化还原反应的重要酶类,其反应底物种类多样,可以是蛋白质,例如脯氨酰羟化酶(PHD),低氧诱导因子(hypoxiainducedfactor)和胶原脯氨酰羟化酶(collagenprolylhydroxylase)等;也可以是小分子化合物,例如核酸,如AlkB、FTO,因而在动物、植物和微生物的初生及次生代谢产物的合成方面起着重要作用。例如,该酶类参与植物激素乙烯、赤霉素和黄酮类化合物等的合成等。最近的研究表明,铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶是最全能且极其重要的氧化生物催化剂。铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶在反应中存在一个共同的机制,即亚铁离子和α-酮戊二酸作为辅助因子,在反应中氧分子的两个氧原子,一个进入底物,另一个参与α-酮戊二酸脱羧基反应生成琥珀酸。目前此类酶活性的检测一般利用同位素标记分析(radioactiveassay)、质谱、核磁共振(NMR)和大分子产物对应底物结构与物理特性的改变等等。这些检测方法繁琐,不适用于大通量药物筛选。此外,现有的检测方法仅适用于一种特定的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶,不具备通用性。
技术实现思路
一方面,本申请提供了铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系,其包括:铁离子、α-酮戊二酸、辅酶A,NTP,琥珀酰辅酶A合成酶。在上述酶活检测体系中,还包括用于起始酶促反应的铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物,以及用于终止酶促反应的钼酸铵溶液和用于显色的孔雀绿溶液。在一实施方案中,所述酶活检测体系中的辅酶A,NTP和琥珀酰辅酶A合成酶三者的浓度为过量,例如,琥珀酰辅酶A合成酶的浓度为过量,而辅酶A和NTP的浓度相同,可为琥珀酰辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍以上。在优选实施方案中,所述酶活检测体系中的钼酸铵溶液和孔雀绿溶液均为强酸性的。另一方面,本申请提供了检测铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活的试剂盒或微阵列,其包括铁离子、α-酮戊二酸、辅酶A、NTP、琥珀酰辅酶A合成酶。在本申请提供的试剂盒或微阵列中,还包括用于起始酶促反应的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物和用于终止酶促反应的钼酸铵溶液和用于显色的孔雀绿溶液。在一实施方案中,所述试剂盒或微阵列中的辅酶A,NTP和琥珀酰辅酶A合成酶三者的浓度为过量,例如,琥珀酰辅酶A合成酶的浓度为过量,而辅酶A和NTP的浓度相同,可为琥珀酰辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍以上。在优选实施方案中,所述酶活检测体系中的钼酸铵溶液和孔雀绿溶液均为强酸性的。又一方面,本申请提供了铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法。在一实施方案中,本专利技术提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法包括以下步骤:a)在待测样品中,加入α-酮戊二酸依赖性双加氧酶作用底物、铁离子、α-酮戊二酸来起始反应进行反应I;b)在步骤a)中的反应I终止之后,再加入辅酶A、NTP、MgCl2和琥珀酰辅酶A合成酶进行反应II;c)加入钼酸铵溶液来终止步骤b)中的反应II,最后加入孔雀绿溶液来显色,并在620-640nm处读取吸光度,由此确定铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。在优选实施方案中,步骤a)中的反应I于100℃下加热来终止,加热时间为,例如30分钟。在优选实施方案中,步骤b)中的反应II加入溶解于硫酸的钼酸铵溶液来终止。在另一实施方案中,本专利技术提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法包括以下步骤:a)在待测样品中,加入α-酮戊二酸依赖性双加氧酶作用底物、铁离子、α-酮戊二酸来起始反应进行反应I,同时加入辅酶A、NTP、MgCl2和琥珀酰辅酶A合成酶进行反应II;b)加入钼酸铵溶液来终止反应,再加入孔雀绿溶液来显色,并在620-640nm处读取吸光度,由此确定铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。此外,本申请还提供了上述的酶活检测体系,上述的试剂盒或微阵列,以及上述的方法在检测铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活中的应用。可见,本申请利用铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶这一类酶催化不同反应后都产生琥珀酸的特性,通过检测反应产生的琥珀酸的量的方法,来检测铁和α-酮戊二酸依赖双加氧酶的活性。与现有技术中检测铁和α-酮戊二酸双加氧酶检测底物的消耗和首要产物的产生,以及由此产生需要依赖层析、质谱或同位素标记等耗时耗力的方法不同,本申请所提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法仅通过检测副产物琥珀酸的产生来检测酶活,测量依赖简单仪器读取可见光光吸收,因而省时省力。附图说明图1为本申请提供的铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法的示例性原理图。图2为本申请实施例1中编码琥珀酰辅酶A合成酶β,α链的sucC和sucD基因的基因图谱。图3为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的PCR扩增产物电泳结果图。图4为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的质粒转化电泳验证结果图。图5为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的蛋白纯化电泳结果图。图6为本申请实施例1中琥珀酰辅酶A合成酶的活性验证,其中1为没有琥珀酸(黄色);2为50μM琥珀酸(没有酶,黄色);3为500μM琥珀酸(没有酶,黄色);4为5μM琥珀酰辅酶A合成酶和50μM琥珀酸(浅绿色);5为0.5μM琥珀酰辅酶A合成酶和500μM琥珀酸(绿色)。图7为本申请实施例1中制作的磷酸浓度标准曲线。图8为本申请实施例1中不同pH条件下,根据不同琥珀酸浓度(10-100μM)建立的琥珀酸辅酶A合成酶反应标准曲线,反应时间为45min。具体实施方式提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明,术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。在本文中所使用的“NTP”,是核苷本文档来自技高网
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铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法

【技术保护点】
铁和α‑酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系,其包括:铁离子、α‑酮戊二酸、辅酶A、NTP、MgCl2和琥珀酰辅酶A合成酶。

【技术特征摘要】
1.铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系,其包括:铁
离子、α-酮戊二酸、辅酶A、NTP、MgCl2和琥珀酰辅酶A合成酶。
2.如权利要求1所述的酶活检测体系,其还包括用于起始反应的
铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的作用底物,以及用于终止反应的钼
酸铵溶液和用于显色的孔雀绿溶液。
3.如权利要求1或2所述的酶活检测体系,其中所述辅酶A,NTP
和琥珀酰辅酶A合成酶三者的浓度为过量,其中辅酶A和NTP的浓
度为琥珀酰辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍以上。
4.检测铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活的试剂盒或微阵列,
其包括权利要求1至3中任一项所述的酶活检测体系。
5.铁和酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法,其包括以下步
骤:
a)在待测样品中,加入α-酮戊二酸依赖性双加氧酶作用底物、
铁离子、α-酮戊二酸进行反应,
b)在步骤a)中的反应终止之后,再加入辅酶A、NTP、MgCl2和
琥珀酰辅酶A合成酶进行反应;
c)加入钼酸铵溶液来终止步骤b)中的反应,最后...

【专利技术属性】
技术研发人员:张雁杨春雨劳滔滔张宥偲
申请(专利权)人:深圳市倍诺博生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:广东;44

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