本发明专利技术公开了与老年痴呆症发病相关的细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点。本发明专利技术所述基因位点是汉族人群中细胞周期依赖性激酶5的rs2069452和rs2069459。本发明专利技术通过聚合酶链式反应等方法检测47例患者及51例年龄匹配正常对照组中细胞周期依赖性激酶5的基因多态性，综合分析基因频率、等位基因频率分布与老年痴呆症发生的相关性分析，结果显示，与正常对照组相比，rs2069452和rs2069459的等位基因频率和单倍体分析结果表明，其与老年痴呆症的发生存在相关性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及与老年痴呆症发病相关的细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点。
技术介绍
神经退行性病变包括老年痴呆症、帕金森氏病等多种疾病，是老年人群发生痴呆症状的最常见的病因。此类疾病引起神经元细胞和突触的退行性变，脑组织萎缩以及记忆力衰退，严重影响了患者的社交、自理能力，导致生活质量大幅度下降。典型的老年痴呆症病理改变包括神经细胞内纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑(senile plaques, SPs)的形成。目前，针对老年痴呆症仍没有有效的治疗手段。细胞周期蛋白依赖性激酶5 (cyclin dependent kinases 5, CDK5)基因位于7 号染色体，含有12个外显子，编码987个碱基长度的mRNA。⑶K5蛋白分子量为33KD，与其激活因子结合后具有激酶活性并能调节细胞周期进程及神经细胞分化。目前大量证据显示，CDK5基因在突触发育，突触可塑性形成中均发挥重要的作用。CDK5活性的异常升高可导致神经细胞死亡，说明CDK5活性的调控对神经细胞存活具有重要的意义。研究表明， Tau蛋白是⑶K5的一个重要底物，在老年痴呆症患者脑部组织中被过度磷酸化，并丧失功能m，进而聚合成NFTs。 在含有大量NFTs的神经元细胞中，⑶K5的活性大大降低，说明了 ⑶K5在NFTs的形成中发挥重要作用M。另一方面，⑶K5可以直接磷酸化淀粉样蛋白前体 (amyloid precursor protein, APP)的668位点，对SPs的形成也是一重要因素。这些研究结果表明，⑶K5不仅能够超磷酸化Tau蛋白，并且还能通过老年斑的形成,从而介导神经元死亡。虽然大量的研究从分子机制角度阐明了 CDK5在AD发生中的作用，但CDK5基因的遗传多态性与AD的关联性研究，特别是在汉族人群中，还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过对⑶K5基因全长测序，并与正常对照组比对，我们从中选中了 5个单核苷酸多态性位点，发现CDK5基因的多态性可能是AD发生地一个危险因素。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现本专利技术通过聚合酶链式反应等方法检测47例患者及51例年龄匹配正常对照组中细胞周期依赖性激酶5的基因多态性，综合分析基因频率、等位基因频率分布与老年痴呆症发生的相关性分析，结果显示，与正常对照组相比，rs2069452和rs2069459的等位基因频率和单倍体分析结果表明，其与老年痴呆症的发生存在相关性。附图说明图f 4为所选取的5个SNPs及其测序图谱。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例病例收集选择从2008年7月-2009年12月在上海复旦大学附属华山医院就诊的原发性老年痴呆病人47例，均为汉族。AD诊断标准参照美国国家神经疾病和中风研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NINDS) / 阿尔茨海默氏症及相关疾病协会(Alzheimer，s Disease and Related Disorders Association, ADRDA)的诊断标准进行。每个病患均由独立两位神经科医生分别进行病史询问及家系调查，包括详细的调查问卷，基础水平测试及外周血采集。51例年龄匹配的正常对照组，来自北京大学深圳医院，排除各种器质性疾病的健康人外周血。所有病人都已对收集样本的目的和意义知情并签字同意，所有采样过程均符合北京大学制定的学术道德规范。聚合酶链反应(polymerasechain reaction, PCR)取静脉血2 ml，肝素抗凝，按外周血总DNA抽提试剂盒(深圳依诺金生物公司)方法制备基因组DNA，用无菌双蒸水稀释基因组DNA为10 mg /L, - 20 °C冻存。常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。PCR反应体系为:50 ml,其中包括2 ml基因组 DNA, 5 ml IOXTaq PCR buffer, 3 ml1. 5 mmol/L MgC12, I ml 10 mmol/L dNTP, 0.5 ml1. 5 U Taq polymerase (以上试剂均购置于大连宝生物公司)。5 mmol/L上游和下游引物(上海生工生物公司)各2 ml。rs2069442和rs2069443的上、下游引物序列如SEQ ID NO: Γ2所示;所述rsl549759和rs2069452的上、下游引物序列如SEQ ID NO: 3 4所示；所述rs2069459的上、下游引物序列如SEQ ID N0:5 6所示。扩增反应在热循环仪(BIO-RAD) 上完成，循环参数为95°C预变性5 min，95 °C变性I min，58 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，共30个循环，最后72 °C延伸8 min，4 °C保存。将PCR产物纯化后送广州英伟创津有限公司测序。等位基因频率和基因型频率计算等位基因频率(allele frequency)和基因型频率(genotypic frequency)采用直接计数法获得。基因型频率指群体中某特定基因型的个体占该群体个体总数的比率，它反映某一基因型个体在群体中的相对数量.等位基因频率指某一基因在群体中的相对数量。具体说，它是指某一等位基因占该基因座上可能出现的全部等位基因总数的比率。任何一基因座位上全部基因频率总和必定等于I。平衡定律检验以卡方检验进行Hardy-Weinberg平衡定律检验。Hardy-Weinberg平衡定律内容为 在适合的条件下群体的基因频率代代相传 ，保持不变，而且不论群体起始基因型频率如何， 经过一代随机交配后，群体的基因型频率将达到平衡，只要平衡条件不变，基因型频率也代代保持不变。多态位点连锁不平衡及单体型分析用最大期望值法HaploView软件估算两位点及多位点的单体型频率，参照文献计算配对连锁不平衡系数D’，/X10_4为具有统计学意义的连锁不平衡，以D’>0. 8为强连锁不平衡。统计学分析用卡方检验分析汉族AD病人间各多态位点基因型和等位基因频率分布的差异。用 Fisher确切概率法检验各多态位点基因型或等位基因频率在病例组和正常人群之间的分布差异。比值比(odd ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, Cl)用于估计研究因素对AD的危险度大小。应用Fihser’ s确切概率法分析各基因型和AD发病的关联。结果所有所选取的样本，包括AD病人和正常对照组，其基本资料见表I。在我们已有的样本量的基础上，分析⑶K5全基因测序结果，与正常对照组相比， 我们最终选择了 5个SNPs，其中分布频率在AD患者超过50%(图1 5)。五个(rs2069442， rs2069443, rsl549759, rs2069452 和 rs2069459)被选定的 SNP(详见图1),均为已知的 SNP 位点。其中 dbSNPs (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/SNP)已列出这 5 个所选 SNP 的基本特征和分布。所选择的本文档来自技高网...
【技术保护点】
与老年痴呆症发病相关的细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点，其特征在于所述位点为rs2069452和rs2069459。
【技术特征摘要】
1.与老年痴呆症发病相关的细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点，其特征在于所述位点为rs2069452和rs2069459。2.一种检测老年痴呆症和细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点相关性的方法，其特征在于包括如下步骤(1)确定老年痴呆病人组和年龄匹配的正常对照组，选取5个已知的细胞周期依赖性激酶5的单核苷酸多态性位点rs2069442、rs2069443、rs 1549759、rs2069452和rs2069459 ；(2)取静脉血，制备基因组DNA进行PCR;所述rs2069442和...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶玉如，万峻，熊轶，陈向军，方征宇，张巨峰，关明，于波，
申请(专利权)人：深圳北京大学香港科技大学医学中心，
类型：发明
国别省市：
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