本发明专利技术涉及一种与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15-1共分离的分子标记及其应用，以抗病品种皖豆15作为父本，感病品种Williams（rps）作为母本，杂交产生F1代，通过自交产生F2:3群体作为作图群体，用已公布的大豆SSR标记和根据大豆基因组序列开发新的SSR标记，对皖豆15含有的抗病基因进行遗传作图和精细定位。抗病基因RpsWD15-1被定位在第17号染色体上，位于标记Sattwd15-24/25(0.5cM)和Sattwd15-47(0.8cM)之间。同时，还获得与基因RpsWD15-1共分离的分子标记Sattwd15-28。该标记可用于大豆抗疫霉根腐病的辅助选择育种中。
【技术实现步骤摘要】
与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWDI5-1共分离的分子标记及其应用
本专利技术属于农业生物技术工程和农作物抗病遗传育种领域，具体地说，涉及一种与大豆抗疫霉根腐病候选基因RPSWD15-1共分离的分子标记及其应用。
技术介绍
由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaμ fmann & Gerdemann)引起的大豆疫霉根腐病是危害大豆生产的主要病害之一。近年来，该病害在大豆主产区黑龙江省危害日益突出，危害大豆面积达15 X IO4公顷。该病害可在大豆的任何生育阶段造成危害，一般田块减产10-30%，严重地块可达60-90%，甚至造成绝产，对大豆生产造成严重威胁。目前，大豆疫霉根腐病已经成为威胁我国大豆生产的常见病害，所以对该病害的防治刻不容缓。实践证明，培育和种植抗病品种是最为安全、经济和有效的措施。为此，许多学者在筛选抗性资源及抗病基因定位方面做了大量的研究。研究表明，大豆对疫霉根腐病的抗性分为质量性状抗性(小种抗性)和数量性状抗性。质量性状抗性由显性基因控制，具有完全抗性。迄今，国外已在大豆基因组9个位点上鉴定了 15个抗大豆疫霉根腐病基因(Rps)， 即 Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld, Rpslk, Rps2, Rps3a, Rps3b, Rps3c, Rps4, Rps5, Rps6, Rps7, Rps8和 theRps gene in cv. Waseshiroge,分别位于大 基因组第 3，16, 13, 18, 18, 18, 3, 13 和3号染色体上(MLG(Sugimoto等，2012)。大豆疫霉根腐病在我国发生的历史较短，抗病育种工作也刚刚起步。目前，我国只鉴定了 4个抗病基因 RpsYB30, RpsYD25, RpsZS18，RpsSNlO分别位于大豆基因组第19，3，2和13号染色体上(MLG L, N, Dlb和F)(范爱颖等，2009，孙石等，2011，姚海燕等，2010，于安亮等，2010，朱振东等， 2007)。我国大豆疫霉具有群体结构复杂，适应范围广和毒力变化快等特点，容易产生新的毒力型小种和克服品种抗性。一般认为大豆疫霉根腐病基因的使用寿命为10-15年，但是新的抗病基因被克服的速度正在加快，如RpsS被鉴定后不到3年，就已发现了能够克服其抗性的新的毒力型的大豆疫霉菌株。大量研究表明国外已鉴定的15个抗病基因中(除 the Rps gene in cv. Waseshiroge外)，除Rpslc和Rpslk外，都不能有效抵抗我国病区的大豆疫霉种群。因此，有必要大力挖掘和利用新的抗性资源并不断地进行抗病基因的累加， 培育抗性持久的大豆品种。为挖掘新的大豆抗性资源，大多数学者借助SSR分子标记(http://soybase.org) 进行抗病基因定位和分子标记辅助选择育种。该类标记具有高信息量、可靠性强、简便和快速等优点，得到广泛的应用。此外利用已公布的大豆基因组序列(http://www. Phytozome. net)开发相应的分子标记，可以对基因进行精细定位，获得基因紧密连锁的分子标记。大豆品种皖豆15是安徽省潘村湖农场农科所用蒙庆13经辐射后系统选育而成的，于1996年通过安徽省品质审定。该品种对大豆病毒病和霜霉病具有高抗性(李俊山 2007)。前期研究结果表明，该品种对不同毒力型的两个大豆疫霉菌株PsMCl和PsMC2均有较强的抗性(朱振东等，2001)。陈晓玲等(2008)和夏长剑等(2011)再次报道皖豆15对大豆疫霉菌株具有广谱抗性，推测其可能含有新的抗病基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记，其中，所述候选基因RpsWD15-l位于大豆第17号染色体上，且位于标记 Sattwdl5-24/25和Sattwdl5_47之间，与这两个标记的遗传距离分别为O. 5cM和O. 8cM。所述分子标记为Sattwdl5_28，含重复基序(AT) 23，且用于扩增分子标记 Sattwdl5-28的PCR引物对为上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。分子标记Sattwdl5_28与候选基因RpsWD15_l的遗传距离为OcM。PCR扩增使用的退火温度优选为48°C，扩增产物大小为123bp。 其中，候选基因RpsWD15_l的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术还提供用于检测与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记Sattwdl5-28的PCR引物对，包括上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。本专利技术还提供与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记在鉴定抗疫霉根腐病大豆品种中的应用，其包括步骤1)提取待测大豆的基因组DNA ;2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用权利要求4所述引物F和R，进行PCR扩增反应；3)检测PCR 扩增产物，如果能够扩增出123bp的产物，则判定为抗疫霉根腐病大豆品种。其中,PCR反应使用的扩增体系以20 μ I计为大豆基因组DNA模板浓度2ng/y L, 10XPCR缓冲液2. 5 μ 1，四种dNTP浓度各为20 μ mol/L，上、下游引物浓度各为O. 2ymol/ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5U,用 ddH20 补足至 20 μ I。PCR反应使用的条件为95°C 3分钟；94°C 50秒，48°C 50秒，72°C 50秒，35个循环；72°C 10分钟。本专利技术还提供含有上述引物对的用于检测抗疫霉根腐病大豆的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的一种或多种。本专利技术还提供上述与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记在植物分子标记辅助育种中的应用。本专利技术进一步提供上述与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分离的分子标记在大S·抗疫霉根腐病分子育种中的应用。具体地，本专利技术的与大S·抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15_l共分尚的分子标记及候选基因RpsWD 15-1是通过以下方法获得的利用WilliamsX皖豆15杂交组合衍生的F2:3群体作为作图群体，研究皖豆15对大豆疫霉根腐病抗性的遗传基础；利用已公布的大豆SSR标记，筛选与抗病基因连锁的分子标记；利用大豆基因组序列信息，开发新的SSR标记，对该基因进行精细定位，同时获得与该基因共分离的分子标记。从而为抗大豆抗疫霉根腐病育种提供辅助选择，提高育种效率，加速抗疫霉根腐病育种工作进程。具体技术方案( I)皖豆15的抗性遗传分析以抗病品种皖豆15作为父本，感病品种Williams (rps)作为母本，杂交产生F1 代，F1代自交产生F2代，F2代自交产生的102个F2:3家系抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图群体。采用下胚轴创伤接种方本文档来自技高网...
【技术保护点】
与大豆抗疫霉根腐病候选基因RpsWD15?1共分离的分子标记，其特征在于，所述候选基因RpsWD15?1位于大豆第17号染色体上，且位于标记Sattwd15?24/25和Sattwd15?47之间，与这两个标记的遗传距离分别为0.5cM和0.8cM；所述分子标记为Sattwd15?28，含重复基序(AT)23，且用于扩增分子标记Sattwd15?28的特异性PCR引物对为：上游引物F：5′?GCTTCCTATCACTCTTTGCTG?3′和下游引物R：5′?TTAGGCTAATGATGCTG?3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱振东，张吉清，王晓鸣，夏长剑，段灿星，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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