一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法技术

本发明专利技术基于illumina公司的Hiseq测序平台提供的接头序列和测序流程，设计了内切酶特异性的粘性末端序列接头，成功的建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于Hiseq2000测序，开发分子标记，从而应用于群体遗传学研究和遗传图谱的绘制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高通量测序领域，尤其涉及一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。
技术介绍
RAD (restriction association site DNA)是酶切位点附近的 DNA 序列标签。 RAD可以作为一种分子标记应用于基因定位，图谱绘制等。RAD标记的密度可以通过在分离的过程中应用不同的内切酶获得。RAD标记技术与第二代测序技术的完美结合，能够快速而且高通量的实现标记开发，图谱绘制等。RAD标记技术能够降低基因组的复杂度，不受基因组序列有无的限制，操作简便，能够快速的开发出大量的分子标记，从而广泛应用于群体的遗传研究。
技术实现思路
为了实现上述的技术目的，本专利技术提供了一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。本专利技术的一个目的是提供两种特殊结构的接头分子A和B。本专利技术提供的双链接头DNA序列分子A，包括正向和反向两条链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P7相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列；反向链与正向链除了突出的粘性末端外，其余序列与正向链互补，并在5’末端进行磷酸化修饰。接头A的结构如图I所示。前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的正向链为序列表中序列I。前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的与illumina公司的 Hiseq2000测序平台测序序列p7相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列I的第5_61位。前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列，为序列表中序列I的第1-4位。前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的反向链为序列表中序列2。前述的提供的双链接头DNA序列分子A，其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列I的第I位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。本专利技术提供的局部双链的接头DNA序列分子B，包括一个长的正向链和一个短的反向链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成 与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸突出末端；反向链与正向链的一部分序列互补并在5’末端进行磷酸化修饰。接头B的结构如图2 所示。前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的正向链为序列表中序列3。前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列3的第1-57位。前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸为序列表中序列3的第58位。前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的反向链为序列表中序列4。前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B，其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列4的第I位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。本专利技术的第二个目的是提供一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，包括如下步骤I)将所述用于标记开发的基因组DNA用特定的限制性内切酶消化，并将所述的接头A与消化产物连接，得到含有接头A的连接产物；2)对步骤I)得到的连接产物进行打碎，打碎大小集中在300— 700bp之间；3)对步骤2)得到的打碎产物纯化回收之后，进行末端补平，加dATP，并进行接头B的连接；4)对步骤3)得到的连接产物进行纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化后，在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；5)进行生物信息分析后，确定酶切位点SNP或INDEL等标记。流程图如图3所/Jn ο前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤I)中， 所述将基因组DNA消化的酶切体系包括酶切缓冲液、限制性内切酶、O. I-Iug的基因组 DNA，所述限制性内切酶在酶切体系中的浓度为O. 5 U/ul ;所述的连接体系包括上述酶切产物、接头A、ATP、连接酶，所述的接头A的浓度为ΙΟΟηΜ，所述的ATP的浓度为ImM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为O. 5 U/ul。前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤2)中， 所述的打碎的条件为使用covaris打碎仪器并调整相应的参数。前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤3)中， 所述的回收打碎产物的方法为采用PCR产物回收试剂盒进行回收；所述的末端补平体系为使用NEB公司的Quick Blunting kit进行；所述的加dATP的体系包括dATP,加A缓冲液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的浓度为5 mM,所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为O. 05 U/ul ;所述的接头B的连接体系包括接头B，ATP、连接酶，所述的接头B的浓度为10 uM，所述的ATP的浓度为ImM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为O. 5 U/ul。前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，步骤4)中， 所述的PCR体系包括引物，聚合酶混合物，以及步骤3)中得到的连接产物。所述的引物的浓度为O. 2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50%的体积。前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法，其中所述的基因组DNA为任何单倍体或二倍体材料的DNA，包括动物、植物、微生物等。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的接头分子A和B，能够连接到DNA片段的两端，运用本专利技术的建库方法，成功的构建了 DNA文库,并成功的运用在illumina公司的Hiseq2000 的测序平台进行测序，获得大量的分子标记位点；同时，可以实现多个样本的混合建库，根据需要调整获取的分子标记的数目。本专利技术提供了一种便捷，高效，快速的标记开发的方法，在居群遗传、图谱绘制、种质评价和鉴定等研究和应用领域有着广泛的应用前景。附图说明图I为接头A的结构示意图；图2为接头B的结构示意图；图3为建库流程示意图；图4为所述材料基因组DNA酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；图5为对酶切基因组DNA产物加上接头A之后的打碎产物的琼脂糖凝胶电泳图(切胶回收前后);图6为对加上接头B的连接产物进行PCR扩增产物的电泳图。具体实施方式下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海 Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品,所用水均为超纯水。I、基因组DNA的酶切和接头A的连接。I)样品浓度测定使用Qubit (美国)对样品DNA浓度测定，进行精准定量，并使用O. 8%琼脂糖凝胶，120v电压，电泳I小时，检测样品质量，确保水稻基因组DNA样品完整无降解。2)以步骤I)检测的水稻基因组DNAlOOngIug为模板进行限制性酶切。反应体系和反应条件如下样品 DNA (150 250 ng/ μ I) O. 1-1 μ g , Restriction Enzyme {EcoRl)Iμ 1，10XNEB Buffer 2 5 μ 1，补加H2O至总体积为50 μ 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种接头序列A，其特征在于，是如下1）或2）的核苷酸：1）由序列表中序列1和2所示的核苷酸序列组成的接头；2）将序列表中序列2的核苷酸残基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种接头序列A，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸 1)由序列表中序列I和2所示的核苷酸序列组成的接头； 2)将序列表中序列2的核苷酸残基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列。2.一种接头序列B，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸 1)由序列表中序列3和4所示的核苷酸序列组成的接头； 2)将序列表中序列4的核苷酸残基序列经过...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋智，刘少卿，彭献军，吴静，
申请(专利权)人：北京诺禾致源生物信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：