本发明专利技术公开了一种用于进行种子植物物种鉴定的特异引物对及其应用。本发明专利技术提供了一对特异引物，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为15-40bp且具有序列表的序列1所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15-40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。本发明专利技术还保护以待测植物的ycf1b基因为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。所述DNA片段可用于辅助进行种子植物物种鉴定。利用本发明专利技术提供的特异引物对，可开发通用试剂盒，有效鉴别陆地植物物种，推动植物DNA条形码发展和服务社会。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于进行种子植物物种鉴定的特异引物对及其应用。
技术介绍
很多社会场合需要知道材料的物种名称，例如药材、待检样品、种子、木材等等，因为只有知道了物种名称，人们才能了解材料。然而，在许多场合下，一般的形态解剖特征不能准确鉴定物种，必须依靠分辨率更高，更准确的遗传信息。用DNA条形码技术鉴别物种正在成为一项常规技术，美国食品与药品监督管理局已经将DNA条形码技术列为应用技术之一。要让DNA条形码技术真正服务于社会，降低技术难度与成本，提高鉴别能力是当务之急。寻找合适的DNA条形码是科学家的神圣使命。对植物来说，虽然植物学家已经付出了巨大努力，但由于植物本身的复杂性和现有数据的缺乏，一些更适合作为DNA条形码的高分辨率基因资源有待于挖掘。DNA条形码技术(DNA barcoding)是一种利用生物遗传物质DNA序列进行物种鉴定的新技术，具有快速鉴定、准确性强、对被鉴定材料完整性的要求低等特点，已成为物种鉴别重要方法之一。DNA条形码技术的关键是DNA条形码(DNA Barcode)。一个理想的DNA 条形码应该具有如下属性(I)鉴别能力高，即种内变异小而种间变异大；(2)引物通用性好，适合没有DNA序列信息的类群且扩增与测序效果好；(3)片段长短合适，最好单向测序能测通，双向测序能准确评估序列的质量并发现错误。在动物中，线粒体上的编码基因片段COl基本符合上述标准。但在植物中，目前还没有发现完全符合上述标准的基因片段。因此，许多系统发育分析常用的叶绿体基因片段， 如 atpF-H、matK、psbK-I、rbcL、rpoB、ropCl、trnH-psbA、trnL-F 和核基因片段 ITS 或者他们的组合被建议作为植物DNA条形码。2009年在墨西哥召开的第三届国际DNA条形码大会上，matK和rbcL被建议作为植物的候选DNA条形码予以评估，trnH-psbA和ITS作为补充条码。2011年，ITS被建议考虑为候选DNA条形码。然而，最近几年的大量评估研究均发现matK和rbcL具有很有限的鉴别能力或者引物通用性不理想。trnH-psbA虽然进化快，但在有的类群中存在倒位和SSR位点等结构，造成测序难和鉴别结果不可靠等问题。ITS是一个比较理想的候选DNA条形码，特别适合较低分类等级的区分，但存在如下问题(1)有的类群协调进化不完全(incomplete concerted evolution),旁系同源拷贝可能造成错误；(2)现存引物不能消除真菌污染；(3)引物通用性不好，PCR扩增和测序均难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于进行种子植物物种鉴定的特异引物对及其应用。本专利技术提供了一对特异引物，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为 15-40bp且具有序列表的序列I所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15_40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。所述单链DNA甲具体可为序列表的序列I所示的DNA片段。所述单链DNA乙具体可为序列表的序列2所示的DNA片段。本专利技术提供的特异引物对的的特点是，是基于多个物种总结设计的，能扩增不同物种，且每个物种的扩增效果均好。所述特异引物对可用于辅助进行种子植物物种鉴定。本专利技术还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用。所述试剂盒的用途为辅助进行种子植物物种鉴定。本专利技术还保护一种包含所述特异引物对的试剂盒。所述试剂盒的用途为辅助进行种子植物物种鉴定。本专利技术还保护以待测植物的ycflb基因为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增得到的DNA片段(分子标记ycfl)。所述DNA片段可用于辅助进行种子植物物种鉴定。以上任一所述种子植物可为被子植物。以上任一所述种子植物具体可为杏属植物、蜡梅科植物、定鸢尾属植物或芍药科牡丹组植物。虽然目前有不少基因片段在不同的时期被不同的人建议为候选的植物DNA条形码，但真正在物种鉴定上没有一个能达到这个目的，尤其是亲缘关系近的物种鉴别。究其原因，要么序列太短，要么变异性低，均不能提供鉴别物种所需的信息。一些基因间隔区，如 atpB-rbcL, trnH-psbA, atpF-H, psbK-I, trnL-F,虽然进化快,但由于属于非编码序列，不能用三联体密码子的方法提高序列比对的可靠性，实现序列错误的内部自动校正和同源性检验。编码基因，如rbcL，序列进化慢，不能提供足够的信息。本专利技术采用杏属植物、蜡梅科植物、定鸢尾属植物或芍药科牡丹组植物等作为例子，与其他被建议作为植物DNA条形码的基因作对比，充分说明分子标记ycfl优于其他基因。既然分子标记ycfl是最优秀的候选植物DNA条形码，为什么一直没有得到应有的重视？引物的通用性可能是ycfl被忽视的最主要原因。由于ycfl的全长超出了 PCR的最适扩增范围，基于其侧翼保守序列设计的引物不能有效扩增ycfl，而其内部的高变异又不能设计出通用引物。其实，这只是由于可用序列少，人们对ycfl缺乏了解的假象。经过专利技术人增加序列后设计的引物具有非常好的通用性，扩增成功率高达95. 81%，明显高于matK 的通用引物。利用本专利技术提供的特异引物对，可开发通用试剂盒，有效鉴别陆地植物物种，推动植物DNA条形码发展和服务社会。附图说明图I为至图9为实施例2中的测序结果。图10为实施例2中的系统发育树。图 11为至图19为实施例3中的测序结果。图20为实施例3中的系统发育树。图21为至图 29为实施例4中的测序结果。图30为实施例4中的系统发育树。图31为至图39为实施例5中的测序结果。图40为实施例5中的系统发育树。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例2至实施例5中，分别将rbcL基因片段、matK基因片段、psbA-trnH基因片段、atpB-rbcL基因片段、trnL-F基因片段、atpF-H基因片段、psbK-I基因片段作为本专利技术提供的特异片段的对照(对照片段)。用于扩增rbcL基因的引物对如下上游引物 5’ ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ ；下游引物5’ -TTGGAAATGGGAAGATCTAGG-3’。用于扩增matK基因的引物对如下上游引物5 ’ -CGATCTATTCATTCAATATTTC-3 ’ ；下游引物5 ’ -TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3 ’。用于扩增p sbA-trnH基因的引物对如下上游引物5’ -CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’ ；下游引物5’ -GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’。用于扩增atpB-rbcL基因的引物对如下上游引物5 ’ -ACATCKARTACKGGACCAATAA-3 ’ ；下游引物5 ’ -AACACCAGCTTTRAATCCAA-3 ’。用于扩增trnL-F基因的引物对如下上游引物5’ -CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ ；下游引物5’ -AITTGAACTGGTGACACGAG-3’。用于扩增atpF-H基因的引物对如下上本文档来自技高网...
【技术保护点】
特异引物对，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为15?40bp且具有序列表的序列1所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15?40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。
【技术特征摘要】
1.特异引物对，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为15_40bp且具有序列表的序列I所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15_40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。2.如权利要求I所述的特异引物对，其特征在于所述单链DNA甲为序列表的序列I所示的DNA片段；所述单链DNA乙为序列表的序列2所示的DNA片段。3.权利要求I或2所述特异...
【专利技术属性】
技术研发人员：周世良，董文攀，徐超，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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