本发明专利技术公开了判定中国人群TNIP1单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。本发明专利技术是采用非标记探针高分辨率溶解曲线法检测位于TNIP1内含子上的SNPrs7708392的基因型，检测结果显示，新发现位于rs7708392上游5bp处尚未报道的SNPrs79937737，而且SNPrs7708392和SNPrs79937737与中国人SLE发病率都不相关。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及判定中国人群TNIPl单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。
技术介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及身体多系统多器官的复杂免疫系统疾病。 遗传和环境因素共同影响SLE的发生发展过程。随着全基因组关联分析(GWAS)的兴起，现已发现一系列SLE相关基因，如MHC、BLK、ITGAM、STAT4、IRF5、BANKl及ETSl等。尽管如此，SLE发病机理仍不是很清楚。在这些候选基因中，TNF诱导蛋白3 (TNFAIP3)结合蛋白 I (TNIPl)的基因多态性与诸多自身免疫系统疾病(如SLE、银屑病等)的发病率显著相关。 TNIPl作为NF-kB的负调节因子，在免疫系统稳态维持中扮演十分重要的角色。TNIPl通过直接与TNFAIP3和IkB的g亚基相互作用和抑制NF_kB前体蛋白pl05的剪切来负性调控 NF-kB信号通路。Gateva等研究发现位于TNIPl内含子上(染色体位置为5q33.1)的SNP rs7708392 (C/G)与欧洲人群SLE的发病率有明显相关性。但是这一关联在中国人群中是否存在尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种判定中国人群TNIPl单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现 一个新的SNPrs79937737，它位于TNIPl基因的内含子区域，位于第5染色体第 150437672核苷酸位置，其前端250个碱基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250个碱基序列如SEQ ID NO:7所示。一种判定中国人群TNIPl单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，所述方法是非标记探针高分辨率溶解曲线法，所述SNP为SNPrs7708392和SNPrs79937737。作为更进一步的优选方案，上述方法包括如下步骤(1)基因分型取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；(2)统计学分析采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率来分析 SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡，用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度，用SHEsis软件进行连锁不平衡及单倍型分析，/7值小于O. 05认为是有统计学意义；(3)统计分析显示，SNPsrs7708392和rs79937737的基因型频在SLE病例组和正常对照组中都符合Hardy - Weinberg平衡，但这两个位点的基因型频率和等位基因频率在SLE 病例组和正常组中并没有显著性差异，单倍型分析显示SNPs rs7708392与rs79937737并不处 于连锁不平衡状态，这两个SNP所产生的单倍型在SLE病例组和正常组中也都没有显著性差异。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术是采用非标记探针高分辨率溶解曲线法检测位于TNIPl内含子上的 SNPrs7708392的基因型，检测结果显示，新发现位于rs7708392上游5bp处尚未报道的 SNPrs79937737，而且 SNPrs7708392 和 SNPrs79937737 与中国人 SLE 发病率都不相关。附图说明图1是用总探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型。 (A)探针区和非探针区的熔融曲线图；(B)标准化后的溶解曲线图显示六种基因型；(C)标准化后的差异曲线图显示六种基因型；图2是对探针去基因序列进行测序的结果，显示两个位点存在突变；图3是引物及总探针、子探针的序列及位置；图4是用子探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型，其中(B)用子探针I进行分析时的探针区和非探针区的熔融曲线图；(C)用子探针I进行分析时的标准化后的溶解曲线图；(D)用子探针I进行分析时的标准化后的差异曲线图；图5是用子探针进行非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本的基因型，其中(E)用子探针2进行分析时的探针区和非探针区的熔融曲线图；(F)用子探针2进行分析时的标准化后的溶解曲线图；(G)用子探针2进行分析时的标准化后的差异曲线图。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例研究人群我们在北京大学深圳医院收集根据美国风湿病学会(ACR)标准确诊的285例SLE病人(男，26例，女，259例；年龄中位数为29岁；年龄跨度在12 - 55岁之间)和336例正常人 (男，28例，女，308例；年龄中位数为28岁；年龄跨度在17-46岁之间)。所有正常人均无 SLE家族史或患其他SLE相关的疾病。本研究获得深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。基因型鉴定采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒(Innogent, China),根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线的方法鉴定样本的基因型。方法简述如下首先进行不对称PCR，20 mL体系含基因组DNA模板20 ng,rPCR 缓存液(Takara, Japan), 200 mM dNTPs, O. 5 U rTaq DNA 聚合酶(Takara, Japan), O. 05 mM 正向引物，O. 5 mM反向引物和O. 5 mM C3封闭的探针。PCR反应在Bio-Rad S1000 PCR仪上进行(Bio-Rad,美国)。PCR扩增条件如下94°C预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，最后72°C延伸5 min。反应结束后，转移10mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入I mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology, USA)后，进行高分辨率溶解曲线分析。溶解温度从55°C上升到90°C，以O. 3°C /s的升温速度采集溶解曲线。用LightScanner软件(Idaho Technology, USA)分析所获得的高分辨率溶解曲线。实验所用的引物和探针均由LightScanner probe design软件设计(Idaho Technology, USA)。引物和探针的序列如下:正向引物SEQ ID N0:1，反向引物SEQ ID NO:2 及三个 C3 封闭的非标记探针 probe SEQ ID NO: 3 ；probe-l SEQ ID NO:4 ；probe-2 SEQ ID N0:5。这些引物和探针所在的位置如图2所示。统计分析采用卡平方检验或Fisher精确检验比较次要等位基因频率(MAF)在病例组与正常组之间的差异来分析SNP是否与疾病相关以及所采集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。 用OR值及95%置信区间的方式表示SNP与疾病之间的关联程度。用SHEsis软件进行连锁不平衡及单倍型分析。P〈0. 05差异有统计学意义。结果非标记探针高分辨率溶解曲线是近年来发展起来的一种高效廉价的SNP检测方法。 与普通高分辨率溶解曲线分析相比，此法利用一小段非标记C3封闭探针来放大突变位置的信息，使得突变位点溶解曲线产生较显著性偏移，产生较好的基因型区分度。通常，此方法获得的溶解曲线能明显区分三种类型基因型(野本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个新的SNPrs79937737，其特征在于位于TNIP1基因的内含子区域，位于第5染色体第150437672核苷酸位置，其前端250个碱基序列如SEQ?ID?NO:6所示，其后端250个碱基序列如SEQ?ID?NO:7所示，此SNP的特征为A/G多态性。
【技术特征摘要】
1.一个新的SNPrs79937737，其特征在于位于TNIPl基因的内含子区域，位于第5染色体第150437672核苷酸位置，其前端250个碱基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250个碱基序列如SEQ ID NO:7所示，此SNP的特征为A/G多态性。2.一种判定中国人群TNIPl单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，其特征在于所述方法是非标记探针高分辨率溶解曲线法，所述SNP为SNPrs7708392和SNPrs79937737。3.根据权利要求2所述判定中国人群TNIPl单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联性的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤 (1)基因分型取外周血基因组DNA，鉴定其基因型； (2)统计学分析采用卡平方检验...
【专利技术属性】
技术研发人员：万峻，于波，邵勇，关明，张伟，陈岳文，董小林，张超，
申请(专利权)人：深圳北京大学香港科技大学医学中心，
类型：发明
国别省市：
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