快速测定囊泡病毒滴度的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，公开了一种用于囊泡病毒滴度的快速检测方法。该方法重悬对数生长期Sf9昆虫细胞；置培养箱中静置培养30分钟至细胞贴壁，弃上清培养基，换用新的Sf‑900IISFM培养基；利用血小球计数板测定细胞浓度；取Sf9昆虫细胞悬液与囊泡病毒稀释液混匀后接种至96孔细胞培养盘；置于培养箱中培养24小时后，每孔加台盼蓝染色液，统计每孔被染色细胞个数、总细胞个数。计算每孔Sf9昆虫细胞死亡率，每孔的死细胞率低于对照组的死细胞率，认定该孔被囊泡病毒侵染，反之则认为该孔未被病毒侵染，根据公式计算囊泡病毒的TCID50。本发明专利技术测定囊泡病毒滴度的方法结合了细胞染色，可用于囊泡病毒滴度的快速测定，测定结果更为准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定病毒滴度的方法，具体地指一种快速测定囊泡病毒滴度的方法。
技术介绍
囊泡病毒(ascovirus)是一类主要侵染鳞翅目夜蛾科昆虫的DNA病毒。囊泡病毒粒子含一个环状超螺旋双链DNA，病毒基因组大小依种的不同从116kbp(DpAV4)到185kbp(HvAV3)不等。囊泡病毒基因组包含两组重复序列。第一组依种的不同大小从1.1kbp到3.8kbp，目前所知在生理上并没有什么特殊的作用。第二组大小约0.3～1.2kbp，编码杆状病毒重复开读框基因序列。囊泡病毒侵染宿主幼虫后宿主幼虫表现为生长发育迟缓，肌肉弹性降低，取食量减少等症状。细胞病理学特征显示侵染初期细胞核肥大，随之核膜破裂，细胞过度增长，细胞质膜嵌入细胞内部，将细胞划分为20～30个小囊。病毒从囊泡内生成，囊泡相互分离后在血淋巴中累积。侵染3、4天后，病毒大量复制，在血淋巴中的浓度达到108个含毒颗粒/毫升，血淋巴呈乳白色，这是囊泡病毒侵染的显著特征。因此，从感病幼虫收集的血淋巴中，除含有大量的病毒粒子外，还含有包含病毒粒子的囊泡。900由于囊泡病毒特殊的细胞病理学特征，迄今未有较为理想的囊泡病毒滴度测定方法，严重影响了囊泡病毒及相关学科的研究进程。而今，病毒学及分子生物学等学科的飞速发展，病毒滴度测定方法呈现简单快速等特点。目前最常见的滴度测定方法有两种，分别为噬斑法和终点稀释法，1)噬斑法(plaque assay)是测定病毒滴度经典且被广大病毒学家较认可的方法，其原理为：单个噬菌斑是由一个病毒粒子产生的，通过噬斑数和稀释度的换算，获得病毒滴度，以噬斑形成单位(PFU/mL)表示。该方法检测时间长，易受细胞质量、单层细胞密度、琼脂糖的一致性、孵育时间和操作者熟练程度等多种因素的影响，且相邻的噬斑可能联合到一起，降低了噬斑数，也可能母斑病毒产生子斑，增加了噬斑数，导致试验重复性差，即结果不同。2)终点稀释法(end-point dilution assay)以50％组织培养侵染剂量(TCID50)表示，是指能使半数单层细胞孔(管)出现病变的病毒稀释度，是使用较广泛的一种病毒含量测定方法，该方法主要通过观察细胞病变来确定病毒的滴度。然而，由于囊泡病毒侵染昆虫细胞引起的细胞病变不明显，漏检及误判可能性非常大，即主观和经验因素对检测结果的影响较大，故依照传统的终点稀释法测定囊泡病毒滴度有很大缺陷。综上所述，由于囊泡病毒特殊的细胞病理学特征以及现有病毒滴度测定方法的明显缺陷，导致目前尚没有一种快速简便测定囊泡病毒滴度的方法。
技术实现思路
本专利技术克服了传统的终点稀释法和噬斑法检测囊泡病毒滴度的技术缺陷，提供一种快速测定囊泡病毒滴度方法，该方法是通过囊泡病毒侵染单层昆虫细胞，致使细胞病变，结合细胞活力染色，在显微镜下观察细胞是否被侵染，统计昆虫细胞死亡率，并计算病毒滴度。为实现上述目的，本专利技术提供的一种快速测定囊泡病毒滴度的方法，包括以下步骤：1)制备昆虫细胞悬液：将昆虫细胞置于Sf-900II SFM液体培养基中进行培养，得到对数生长期的昆虫细胞，然后用Sf-900II SFM液体培养基对昆虫细胞进行稀释，得到昆虫细胞悬液，其中，Sf-900II SFM液体培养基购于gibco公司；2)制备待测囊泡病毒稀释液：将待测囊泡病毒使用Sf-900II SFM液体培养基十倍梯度稀释备用，得到不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液；3)制备细胞病毒悬液：将步骤2)得到的不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液分别与步骤1)得到昆虫细胞悬液混合，得到不同稀释度的细胞病毒悬液；4)囊泡病毒侵染：将步骤3)得到不同稀释度的细胞病毒悬液接种至细胞培养盘内，置于细胞培养箱中培养20～30h，在20～30h内细胞凋亡明显，但病毒侵染时间过长，被病毒侵染的细胞破裂，释放出病毒粒子和囊泡，不利于后续染色试验和死细胞个数统计；5)台盼蓝染色：取出上述细胞培养盘，并向细胞培养孔中滴加台盼蓝染色液染色，混合均匀，染色2～3分钟，在显微镜下计数每孔被染色的死细胞个数和细胞总个数；6)囊泡病毒滴度计算：根据每孔的死细胞个数和细胞总个数计算每孔细胞死亡率，即每孔细胞死亡率＝每孔死细胞个数/该孔细胞总个数，从而统计细胞培养盘中，每个稀释度细胞病毒悬液的侵染孔数；计算囊泡病毒的TCID50。进一步地，所述步骤1)中，昆虫细胞的为草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda卵巢细胞Sf9细胞、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞Sf21细胞、粉纹夜蛾Trichoplusia ni Hǜbner卵细胞系Hi5细胞中任意一种。再进一步地，所述步骤1)中，所述昆虫细胞悬液中，昆虫细胞的个数为1.0～9.9×105个/mL。再进一步地，所述步骤2)中，囊泡病毒为HvAV3、SfAV1、TnAV2和SeAV5中任意一种。再进一步地，所述步骤2)中，待测囊泡病毒稀释液的稀释度的梯度为2～10。再进一步地，所述步骤3)中，待测囊泡病毒稀释液与昆虫细胞悬液的体积比为1∶8～15。再进一步地，所述步骤4)中，细胞病毒悬液接种至细胞培养盘的具体步骤如下：1)处理组：每一排或列的细胞培养孔内均接种同样稀释度的细胞病毒悬液，2)对照组：保留一排或列的细胞培养孔内均接种Sf-900II SFM液体培养基与昆虫细胞悬液的混合液；其中，每个孔的接种量均为100～200μL。再进一步地，所述步骤5)中，台盼蓝染色液的质量分数为0.3～0.6％，台盼蓝染色液滴加量为7～30μL。再进一步地，所述步骤6)中，根据每孔细胞死亡率计算对照组的平均细胞死亡率，即对照组的平均细胞死亡率＝对照组每孔细胞死亡率之和/对照组孔数；比较处理组每孔细胞死亡率和对照组的平均死亡率，判断接种病毒的处理组是否被病毒侵染，若处理组的某孔内细胞死亡率大于对照组的平均细胞死亡率，则判定该孔被病毒侵染，即该孔为阳性，或，若处理组的某孔内细胞死亡率小于对照组的平均细胞死亡率，则判定该孔未被病毒侵染，即该孔为阴性；由上述判定统计每个病毒稀释度处理组的侵染孔数，计算该病毒稀释度处理组的侵染率，即每组处理侵染率＝该组侵染孔数/该组总孔数，从而根据Reed-Muench法计算囊泡病毒的TCID50即，距离比例＝(高于50％的病变率-50％)/(高于50％的病变率-低于50％病变率)lgTCID50＝高于50％病变的病毒最高稀释度的对数-距离比例。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方法操作简单、结果精确、耗时短、稳定性好。该方法能以较高的检测准确度测定囊泡病毒滴度；本专利技术所述的滴度检测方法测定囊泡病毒滴度仅需2天，而传统的终点稀释法则需要8-10天，噬斑形成需要很多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期，大大缩短了检测时间。囊泡病毒侵染细胞后没有明显的细胞病变特征，单纯的显微镜观察无法判断细胞是否被病毒侵染，故传统的终点稀释法无法准确检测囊泡病毒滴度。相比较传统的终点稀释法和噬斑法，本专利技术所述方法检测周期缩短6-8天，检测效率高，不仅大大缩短了操作时间，节约成本，实验结果更具预料性，在不同操作个体间也更精确稳定。本专利技术对操作人员的要求相对较低，不可控因素较小，实验结果的操作稳定性较高。具体实施方式为了更好地解释本专利技术，以下结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速测定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备昆虫细胞悬液：将昆虫细胞置于Sf‑900II SFM液体培养基中进行培养，得到对数生长期的昆虫细胞，然后用Sf‑900 II SFM液体培养基对昆虫细胞进行稀释，得到昆虫细胞悬液，2)制备待测囊泡病毒稀释液：将待测囊泡病毒使用Sf‑900 II SFM液体培养基十倍梯度稀释备用；得到不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液；3)制备细胞病毒悬液：将步骤2)得到的不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液分别与步骤1)得到昆虫细胞悬液混合，得到不同稀释度的细胞病毒悬液；4)囊泡病毒侵染：将步骤3)得到不同稀释度的细胞病毒悬液接种至细胞培养盘内，置于细胞培养箱中培养20～30h；5)台盼蓝染色：取出上述细胞培养盘，并向细胞培养孔中滴加台盼蓝染色液染色，混合均匀，染色2～3分钟，在显微镜下计数每孔被染色的死细胞个数和细胞总个数；6)囊泡病毒滴度计算：根据每孔的死细胞个数和细胞总个数计算每孔细胞死亡率，即每孔细胞死亡率＝每孔死细胞个数/该孔细胞总个数，从而统计细胞培养盘中，每个稀释度细胞病毒悬液的侵染孔数；计算囊泡病毒的TCID50。

【技术特征摘要】
1.一种快速测定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备昆虫细胞悬液：将昆虫细胞置于Sf-900II SFM液体培养基中进行培养，得到对数生长期的昆虫细胞，然后用Sf-900 II SFM液体培养基对昆虫细胞进行稀释，得到昆虫细胞悬液，2)制备待测囊泡病毒稀释液：将待测囊泡病毒使用Sf-900 II SFM液体培养基十倍梯度稀释备用；得到不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液；3)制备细胞病毒悬液：将步骤2)得到的不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液分别与步骤1)得到昆虫细胞悬液混合，得到不同稀释度的细胞病毒悬液；4)囊泡病毒侵染：将步骤3)得到不同稀释度的细胞病毒悬液接种至细胞培养盘内，置于细胞培养箱中培养20～30h；5)台盼蓝染色：取出上述细胞培养盘，并向细胞培养孔中滴加台盼蓝染色液染色，混合均匀，染色2～3分钟，在显微镜下计数每孔被染色的死细胞个数和细胞总个数；6)囊泡病毒滴度计算：根据每孔的死细胞个数和细胞总个数计算每孔细胞死亡率，即每孔细胞死亡率＝每孔死细胞个数/该孔细胞总个数，从而统计细胞培养盘中，每个稀释度细胞病毒悬液的侵染孔数；计算囊泡病毒的TCID50。2.根据权利要求1所述快速测定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤1)中，昆虫细胞的为草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞Sf9细胞、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞Sf21细胞、粉纹夜蛾Trichoplusia ni卵细胞系Hi5细胞中任意一种。3.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述昆虫细胞悬液中，昆虫细胞的个数为1.0～9.9×105个/mL。4.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤2)中，囊泡病毒为HvAV3、SfAV1、TnAV2和Se...

【专利技术属性】
技术研发人员：万虎，韩宁宁，李建洪，陈子姝，黄国华，
申请(专利权)人：华中农业大学，湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42