一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法技术

本发明专利技术公开一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，利用家蚕后部丝腺生产具有广泛用途和经济价值的Ⅰ型类人胶原蛋白。该方法获得的重组I型类人胶原蛋白能够在家蚕丝腺中稳定表达，并在后代延续。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
和家蚕领域，特别涉及基因工程领域，通过基因重组的办法在家蚕丝腺中获得了重组I型类人胶原蛋白表达。
技术介绍
胶原蛋白是哺乳动物结缔组织关键的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白凭借其强度和稳定性，以及与活体组织的兼容性，作为生物材料被广泛应用于多种医疗领域和美容保健等方面。纤维状胶原蛋白主要分为I，II，III，V，XI五类，不同类型胶原蛋白在组织细胞及生理功能等有明显差异。I型胶原蛋白是最主要和最先被鉴定的纤维状胶原蛋白，是结缔组织与骨骼的主要蛋白质，对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号起重要作用。目前，胶原蛋白的主要来源是动物皮肤，而这种来源含有高致病风险，同时也可能会引起过敏性反应。随着对胶原蛋白需求的日益增加，原先从屠宰动物体的皮革、骨骼中提取胶原的方式已经不能满足日益增长的胶原蛋白的需求，而且还可能有致病之虞。因此，急需要一种能够代替此来源，并大量生产胶原蛋白的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，公开一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，利用家蚕后部丝腺生产具有广泛用途和经济价值的Ⅰ型类人胶原蛋白。该方法获得的重组I型类人胶原蛋白能够在家蚕丝腺中稳定表达，并在后代延续。本专利技术的技术方案如下：一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，包括：1)构建转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP；2)将转基因质粒pB FL-HCool-I-pA-FL-BmP4Hα-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1﹕1，总DNA浓度为400 ng/μL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2～5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10～15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后,蚕卵放在25℃、90%湿度的培养箱中培育孵化；3)G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。优选的，构建转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP包括：1)扩增克隆HCool-I cDNA；2)构建pMD-FL-HCool-I-pA载体；3)构建pB FLHCool-I- A3EGFP载体；4)构建pMD-FL-BmP4Hα-pA载体；5)构建目标载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP。优选的，HCool-I cDNA序列如序列1所示；同样优选的，HCool-I cDNA序列翻译的蛋白序列如序列2所示；更为优选的，fib -L启动子序列如序列3所示；再优选的，BmP4Hα cDNA序列如序列4所示；本专利技术还包括一个优选的技术方案，经显微注射后的蚕卵在培养箱中培育孵化条件为25℃、90%湿度。更进一步的，G1代幼虫由所述的显微注射后的蚕卵放在25℃、90%湿度的培养箱中培育孵化，经约11d左右孵化，孵化出的幼虫G0代用桑叶饲养至结茧，羽化后与正常的蚕蛾交配，由雌蛾产生G1代蚕卵，单独孵化为G1代幼虫。本专利技术方法与现有技术相比，具有以下有益效果：通过将HCool-I cDNA和家蚕脯氨酰4-羟化酶α-亚基cDNA同时转入早期胚胎并通过丝素轻链(fib-L)启动子在后部丝腺表达，获得具有完整生物学功能的I型类人胶原蛋白，并揭示在家蚕中稳定遗传表达I型类人胶原蛋白的方法。附图说明图1：显微注射示意图；图2：I型类人胶原蛋白转基因家蚕阳性个体EGFP标记的荧光检测图，其中A图是在体视显微镜下对照图，检测无荧光；B图为显微注射后的幼虫在体视显微镜下存在荧光现象；C图为5龄4天幼虫在小动物活体成像系统的荧光现象，其中C图左侧两条家蚕幼虫为对照，右侧两条家蚕幼虫是经过显微注射转基因质粒的蚕卵经培养的幼虫，能明显观察到绿色荧光现象，确认幼虫阳性EGFP荧光。具体实施方式本专利技术家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，包括：1)构建转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP；2)将转基因质粒pB FL-HCool-I-pA-FL-BmP4Hα-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1﹕1，总DNA浓度为400 ng/μL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2～5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10～15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后,蚕卵放在25℃、90%湿度的培养箱中培育孵化；3)G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。为了更好地说明本专利技术，便于理解本专利技术的技术方案，本专利技术的典型但非限制性的实施例如下：实施例一：转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP的构建1.扩增及克隆HCool-I cDNA：I型类人胶原蛋白（HCool-I）cDNA的人工设计与RT-PCR扩增参考人类I型胶原蛋白基因序列(GenBank Accession No. Z74615)及能促进细胞信号传导、基质金属蛋白酶的生成和细胞胶原蛋白相互作用等发挥重要生理功能的特征序列，设计引物：HCool-I-F：5’-CCCCCGGGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGG-3’，HCool-I- R：5’-CGGGGTACCCTAGCGTTCACCTGGTAGGCCAAC-3’，（分别设计Sma I和Kpn I限制性内切酶位点）；以I型类人胶原蛋白（HCool-I）cDNA克隆作为RT-PCR扩增模板，扩增HCool-I片段，回收目的片段并与pMD-20T载体连接，筛选出阳性克隆并测序，DNAStar 5.0 分析软件分析测序结果，确证扩增序列。家蚕脯氨酰4-羟化酶α-亚基BmP4Hα cDNA的扩增参考家蚕(GenBank Accession No. AY099068) 设计引物：BmP4Hα-F：5’-CCCATATGATGGAAACAGTAAGAGCGATAGCT-3，BmP4Hα- R：5’-CGCGGATCCCTACCTGGATGTCTTCGGCACTGG-3’，（分别设计NdeI和BamHI限制性内切酶位点）；回收目的片段并与pMD-20T载体连接，筛选出阳性克隆并测序，DNAStar 5.0 分析软件分析测序结果，经序列比对分析，确证扩增序列，详见序列1，该序列与I型类人胶原蛋白（HCool-I）cDNA并不完全一样，其区别在于截取I型类人胶原蛋白（HCool-I）cDNA部分效应cDNA，使其使用与家蚕丝腺后部表达，其表达蛋白的氨基酸序列如序列2所示，其中GPQGIAGQRGVVGLP（P，Hyp）序列具有促进细胞信号传导、基质金属蛋白酶的生成，具有高度活跃的成纤维细胞结合性等功能，GER三肽序列具有参与细胞附着、血小板聚集，GER对于血管生成也是必须的。2.构建pMD-FL-HCool-I-pA载体：将已克隆到pMD-20T载体的HCool-I cDNA用SmaI和Kpn I双切酶，回收片段连接到通过同样酶切的含fib-L启动子序列和polyA加尾信号序列的中间载体pMD-FL-pA中，构建成pMD-FL-HCool-I-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于：包括：(1).构建转基因载体pBFLHCool‑I‑FLBmP4Hα‑A3EGFP；(2).将转基因质粒pB FL‑HCool‑I‑pA‑FL‑BmP4Hα‑pA‑A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1﹕1，总DNA浓度为400 ng/μL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2～5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10～15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后,经显微注射后的蚕卵放在25℃、90%湿度的培养箱中培育孵化；(3).G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。

【技术特征摘要】
1.一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于：包括：(1).构建转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP；(2).将转基因质粒pB FL-HCool-I-pA-FL-BmP4Hα-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1﹕1，总DNA浓度为400 ng/μL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2～5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10～15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后,经显微注射后的蚕卵放在25℃、90%湿度的培养箱中培育孵化；(3).G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。2.如权利要求1所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于：所述的构建转基因载体pBFLHCool-I-FLBmP4Hα-A3EGFP包括：(1).扩增克隆HCool-I cDNA；(2).构建pMD-FL-HCool-I-pA载体；(3).构建pB FLHCool-I- A3EGFP载体；(4).构建pMD-FL-BmP4Hα-pA载体；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐豫松，王华兵，占鹏飞，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33