石斛原球茎多糖的提纯方法技术

本发明专利技术提供一种石斛提取方法，具体涉及一种石斛原球茎多糖的提纯方法,该方法采用超声波强化提取手段、运用层析法对石斛原球茎水溶性粗多糖进行分离和纯化，从而获得石斛原球茎多糖的纯品,包括石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤及石斛原球茎多糖分离纯化的步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种石斛提取方法，具体涉及一种石斛原球茎多糖的提纯方法。
技术介绍
石斛（Dendrobiumcandidum)是兰科石斛属植物，为我国名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效。由于石斛生境十分狭窄，且多年来对其过度采挖，加之试管苗的移栽成活率低，造成了石斛药源供需紧张。原球茎（Protocorm）是石斛离体培养产生的胚性组织,同样具有植株的物质代谢和形态发育的潜能。于是，提出用原球茎代替原植株成为药源的可能性。而多糖是石斛的主要活性成分，有资料报道石斛多糖能增强机体免疫力，是一种很有价值的中药、免疫类增强剂。但是，目前国内外对石斛原球茎多糖方面的研究鲜有报道。现有技术中，石斛多糖传统提取主要包括如下步骤：脱脂，浸提，浓缩，脱蛋白，醇沉和干燥。脱脂中有的采用有毒的有机试剂~石油醚（如专利：保肝抗肝纤维化活性石斛多糖及其抗体亲和层析制备方法-CN102504043A、一种铁皮石斛多糖提取物、其药物组合物和其制备方法及其应用-CN101015649A）；浸提中有采用了微波处理（如专利：一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法-CN102391385A，一种降糖活性石斛多糖及其提取方法-CN101979639A），微波能耗高，设备贵，有潜在辐射泄漏危害人体健康，且微波处理对石斛多糖的提取效果在专利中也未有单因素对比实验证明；而脱蛋白有的采用有毒的有机试剂~氯仿和正丁醇抽提（如专利：一种铁皮石斛多糖提取物、其药物组合物和其制备方法及其应用-CN102504043A，保肝抗肝纤维化活性石斛多糖及其抗体亲和层析制备方法-CN102504043A，一种金钗石斛多糖提取物的制备和应用-CN101407557）。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提出一种石斛原球茎多糖的提纯方法,该方法采用超声波强化提取手段、运用层析法对石斛原球茎水溶性粗多糖进行分离和纯化，从而获得石斛原球茎多糖的纯品。为解决此技术问题，本专利技术采取以下方案：石斛原球茎多糖的提纯方法，包括石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤及石斛原球茎多糖分离纯化的步骤：所述石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤包括：1）干燥粉碎：取石斛干燥茎，55~65℃真空干燥2h，并对干燥后的石斛干燥茎进行粉碎，粉碎后过70~90目筛，得到石斛粉；2）超声水浴提取：按料液比1：30~35的比例将石斛粉和纯水混合后，置不锈钢圆筒进行超声波水浴加热提取，提取温度40~55℃，提取时间85~100min，超声波频率40~50kHz，超声功率恒定为280-320W，得到的提取液；3）离心浓缩处理：将得到的提取液进行离心去渣，取上清液用旋转蒸发仪进行浓缩处理，再用4倍体积95%乙醇沉淀7~9h，取出沉淀物用适量纯水溶解，14500~15500r/min离心8~12min，倒去上清，得到离心沉淀物；4）冻干保存：对离心得到的沉淀物进行冻干保存，即得到石斛原球茎粗多糖；所述石斛原球茎多糖分离纯化的步骤包括：1）石斛原球茎粗多糖的柱分离：用纯水将冻干的粗多糖DCPP配成质量浓度约18~22g/L的水溶液，离心，进DEAE-52纤维素柱分离，每次上样量为9~11mL，得到5种多糖组分DCPP1a，DCPP2b，DCPP3c，DCPP4d，DCPP5e；2）洗脱并制定洗脱分制图：先以纯水充分洗脱中性多糖，随后分别以浓度为0.05、1.0、2.0mol/L的NaCl相继分段梯度洗脱，洗脱速率为0.5mL/min,，以每管5mL收集洗出液，用苯酚-硫酸法于470~510nm处显色测定多糖峰位的吸光值，依有关数据制定多糖的洗脱分布图；3）合并、浓缩、透析、醇沉、冻干洗脱液：合并主要糖组分的洗脱液，将其浓缩，装入透析袋夹紧，在流水和蒸馏水中分别透析48、24h,醇沉、冻干后得到5个组分DCPP1a，DCPP2b，DCPP3c，DCPP4d，DCPP5e；4）SephadexG-200柱分离纯化：接着用SephadexG-200柱分离纯化，以0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.3~0.4mL/min，以每管2.5~3.5mL分别收集各峰对应组分的洗脱液，收集各峰，经透析、浓缩、醇沉、洗涤、冻干得多糖DCPP，最后进行多糖纯度鉴定。进一步改进的是:所述多糖纯度鉴定包括如下步骤：1）运用SepadexG-200凝胶柱层析法，将10mg冻干的DCPP溶于1mL蒸馏水中，加到已用0.1mol/LNaCl平衡的凝胶柱SephadexG-200中；以0.1mol/LNaCl洗脱；流速0.2mL/min，以每管1.5mL收集流出液，苯酚-硫酸法显色检测流出液是否有单一对称峰；2）运用比旋度法，将冻干的不同浓度乙醇沉淀的所得物多糖复溶于蒸馏水，用10cm的测定试管，钠灯光源，蒸馏水调零点，20℃下测定其旋光度值；3）运用紫外光谱分析法，将DCPP配制成质量浓度约0.5g/L的水溶，,以蒸馏水为空白对照，于190~400nm的波段进行紫外扫描。进一步改进的是:所述石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤3）中的离心去渣的转速为4800~5300 r/min。通过采用前述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术有以下优点：（1）提取工艺环保无毒：在超声提取过程中，无添加任何有机溶剂，完全避免了有毒的有机溶剂对产品的污染。（2）提取工艺简便易操作：本专利技术采用超声波强化提取手段，对石斛原球茎多糖DCPP粗品进行了系统的提取，它通过机械、热学及空化等作用，加速目标成分进入溶剂，从而大大提高了提取效率，节约了溶剂，有效地避免了二次污染，非常适于工业化和自动化的规模生产，可以有效地减少劳动强度。（3）样品纯度高：经超声提取及层析获得的DCPP纯品，其纯度≥95%，多糖的平均提取得率为18%，完全符合国家对保健品和药品添加组份的纯度标准。（4）本工艺方法简单，操作方便，成本低廉，非常适于工业化和自动化的大规模制备。附图说明图1粗多糖DCPP过DEAE-纤维素柱的分离曲线；图2 DCPP的SephadexG-200纯度鉴定图谱。具体实施方式现结合和具体实施例对本专利技术进一步说明。实施例一：本专利技术实施例一公开一种石斛原球茎多糖的提纯方法，包括石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤及石斛原球茎多糖分离纯化的步骤：所述石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤包括：1）干燥粉碎：取石斛干燥茎，60℃真空干燥2h，并对干燥后的石斛干燥茎进行粉碎，粉碎后过80目筛，得到石斛粉；2）超声水浴提取：按料液比1：30的比例将100 g石斛粉和3L纯水混合后，置不锈钢圆筒进行超声波水浴加热提取，提取温度50℃，提取时间95min，超声波频率45kHz，超声功率恒定为300W，得到的提取液；3）离心浓缩处理：将得到的提取液进行离心去渣，离心转速为5 000 r/min，取上清液用旋转蒸发仪进行浓缩处理，再用4倍体积95%乙醇沉淀8h，取出沉淀物用适量纯水溶解， 15000r/min离心10min，倒去上清，得到离心沉淀物；4）冻干保存：对离心得到的沉淀物进行冻干保存，即得到石斛原球茎粗多糖；所述石斛原球茎多糖分离纯化的步骤包括：1）石斛原球茎粗多糖的柱分离：用纯水将冻干的粗多糖DCPP配成质量浓度约20g/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】
石斛原球茎多糖的提纯方法，其特征在于：包括石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤及石斛原球茎多糖分离纯化的步骤：所述石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤包括：1）干燥粉碎：取石斛干燥茎，55~65℃真空干燥2h，并对干燥后的石斛干燥茎进行粉碎，粉碎后过70~90目筛，得到石斛粉；2）超声水浴提取：按料液比1：30~35的比例将石斛粉和纯水混合后，置不锈钢圆筒进行超声波水浴加热提取，提取温度40~55℃，提取时间85~100min，超声波频率40~50kHz，超声功率恒定为280‑320W，得到的提取液；3）离心浓缩处理：将得到的提取液进行离心去渣，取上清液用旋转蒸发仪进行浓缩处理，再用4倍体积95%乙醇沉淀7~9h，取出沉淀物用适量纯水溶解，14500~15500r/min离心8~12min，倒去上清，得到离心沉淀物；4）冻干保存：对离心得到的沉淀物进行冻干保存，即得到石斛原球茎粗多糖；所述石斛原球茎多糖分离纯化的步骤包括：1）石斛原球茎粗多糖的柱分离：用纯水将冻干的粗多糖DCPP配成质量浓度约18~22g/L的水溶液，离心，进DEAE‑52纤维素柱分离，每次上样量为9~11mL，得到5种多糖组分DCPP1a，DCPP2b，DCPP3c，DCPP4d，DCPP5e；2）洗脱并制定洗脱分制图：先以纯水充分洗脱中性多糖，随后分别以浓度为0.05、1.0、2.0mol/L的NaCl相继分段梯度洗脱，洗脱速率为0.5mL/min,，以每管5mL收集洗出液，用苯酚‑硫酸法于470~510nm处显色测定多糖峰位的吸光值，依有关数据制定多糖的洗脱分布图；3）合并、浓缩、透析、醇沉、冻干洗脱液：合并主要糖组分的洗脱液，将其浓缩，装入透析袋夹紧，在流水和蒸馏水中分别透析48、24h,醇沉、冻干后得到5个组分DCPP1a，DCPP2b，DCPP3c，DCPP4d，DCPP5e；4）SephadexG‑200柱分离纯化：接着用SephadexG‑200柱分离纯化，以0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.3~0.4mL/min，以每管2.5~3.5mL分别收集各峰对应组分的洗脱液，收集各峰，经透析、浓缩、醇沉、洗涤、冻干得多糖DCPP，最后进行多糖纯度鉴定。...

【技术特征摘要】
1.石斛原球茎多糖的提纯方法，其特征在于：包括石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤及石斛原球茎多糖分离纯化的步骤：所述石斛原球茎多糖DCPP超声提取的步骤包括：1）干燥粉碎：取石斛干燥茎，55~65℃真空干燥2h，并对干燥后的石斛干燥茎进行粉碎，粉碎后过70~90目筛，得到石斛粉；2）超声水浴提取：按料液比1：30~35的比例将石斛粉和纯水混合后，置不锈钢圆筒进行超声波水浴加热提取，提取温度40~55℃，提取时间85~100min，超声波频率40~50kHz，超声功率恒定为280-320W，得到的提取液；3）离心浓缩处理：将得到的提取液进行离心去渣，取上清液用旋转蒸发仪进行浓缩处理，再用4倍体积95%乙醇沉淀7~9h，取出沉淀物用适量纯水溶解，14500~15500r/min离心8~12min，倒去上清，得到离心沉淀物；4）冻干保存：对离心得到的沉淀物进行冻干保存，即得到石斛原球茎粗多糖；所述石斛原球茎多糖分离纯化的步骤包括：1）石斛原球茎粗多糖的柱分离：用纯水将冻干的粗多糖DCPP配成质量浓度约18~22g/L的水溶液，离心，进DEAE-52纤维素柱分离，每次上样量为9~11mL，得到5种多糖组分DCPP1a，DCPP2b，DCPP3c，DCPP4d，DCPP5e；2）洗脱并制定洗脱分制图：先以纯水充分洗脱中性多糖，随后分别以浓度为0.05、1.0、2.0mol/L的NaCl相继分段梯度洗脱，洗脱速率为0.5mL/min,，以每管5mL收集洗出液，用苯酚-硫酸法于470~510nm处显色测定多糖峰位的吸光值，依有关数据制定...

【专利技术属性】
技术研发人员：林潘海，周克权，
申请(专利权)人：镇江劲草堂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32