党参均一多糖COP-2及其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种党参均一多糖COP‑2及其制备方法及应用。本发明专利技术从党参中发现的一种新的中性均一多糖，经丙烯酰胺葡聚糖凝胶（Sephacryl S‑200HR）和葡聚糖凝胶（Sephadex G‑25）纯化得到该多糖，获得途径方便；其产品可以进一步衍生化如硫酸化或硝酸化衍生，而且还具有增强免疫力的作用以及具有抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的作用，具有很高的临床应用价值及保健功能。本方法简单、科学合理，只需要经过葡聚糖凝胶柱就可以快速得到高纯度的产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药学领域，尤其是一种党参均一多糖COP-2及其制备方法及应用。
技术介绍
党参(Radix Codonopsis)为桔梗科党参属植物，干燥根入药，可补中益气，健脾益肺，用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消咳，为传统的补益药。近年来的研究报道，党参有丰富的化学成分，主要是挥发油、生物碱、甙、多糖等。在过去几年国内外研究了多糖的生物活性，明确多糖化学结构在理解结构和功能性质之间的关系发挥重要作用。在党参多糖抗单纯疱疹病毒的研究中，我们发现了3k-10kDa分子量的硫酸化党参多糖有抗病毒作用。为了探索其抗病毒的活性机制，则需要更加明确分析党参多糖的结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种党参均一多糖COP-2及其制备方法及应用。本专利技术是这样实现的：党参均一多糖COP-2，该多糖是分子量为9900的β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，该多糖的还原端与α-D-Glc相连。党参均一多糖COP-2的制备方法，包括以下步骤：1）将干燥党参块根，剪切成1cm小节，用6-10重量倍、且质量浓度为60-80％的乙醇回流3次，，乙醇液弃之，将药渣水用6-10重量倍的蒸馏水提2-3次，将水提液减压浓缩至0.5-1.0g/ml，加入质量浓度为85-95％乙醇至含醇量达80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色党参粗多糖粉末；2）将党参粗多糖粉末完全溶解于蒸馏水中，获得多糖溶液，将多糖溶液在4000rpm条件下离心10min，弃去不溶物，留取上清液备用；3）将上清液上Sephacryl S-200HR，以0.2M氯化钠作为洗脱液，恒流泵的流速为0.5ml/min，每管接收时间为5.5min，用苯酚硫酸法做洗脱曲线，收集主峰溶液；接着再上Sephadex G-25柱，合并主峰溶液并浓缩，3500Da透析2d，冷冻干燥后，得到党参均一多糖COP-2。党参均一多糖COP-2在制备提高免疫能力药物中的应用。党参均一多糖COP-2在制备抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药物中的应用。党参均一多糖COP-2的党参多糖硫酸酯的制备方法，将党参均一多糖COP-2用氨基磺酸法对进行硫酸化修饰，修饰条件为党参均一多糖COP-1与氨基磺酸的摩尔质量比为1：0.04g/mol，80℃，反应时间15-40 min。获得取代度为0.28-0.56的党参多糖硫酸酯。为了进一步验证本专利技术的技术方案，专利技术人进行了如下实验：一、党参均一多糖COP-2的获取：按照上述方法提取获得党参均一多糖COP-2。二、鉴定： 对用本专利技术提取方法获得的党参多糖COP-2采用高效液相法进行纯度和分子量鉴定。色谱条件：Ultrahydrogel 250色谱柱，流动相为0.2mol/l，流速0.6ml/min，柱温30℃，检测器为RID（示差折光检测器）。多糖用适量水溶解，进样10μl，呈单一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖。见图2。取1mg分子量为1K、5K、12K、25K、50KDa的普鲁兰多糖分别溶于1ml的水溶液中，色谱条件同上，高效液相分析。记录保留时间，以分子量的对数为纵坐标，保留时间为横坐标，得标准曲线logM=2.544+0.6998X-0.0473X2，（M为重均分子量，X为时间，min）见图3，将COP-2出峰时间代入曲线方程，得COP-2的重均分子量为9900Da。对用本专利技术提取方法获得的党参多糖COP-2进行结构测定： COP-2经纯度鉴别，证明已是单一组成，可以进行结构分析。标准单糖液相分离：取适量的四种单糖（木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖）溶解，微孔滤膜过滤上高效分析。色谱条件：检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；色谱柱为Xbridge BEH Amide(4.6×250mm)；流动相为A相：80%乙腈水溶液含0.2%三乙胺；B相：30%乙腈水溶液含0.2%三乙胺；梯度洗脱：A相100%-40%-100%；时间：0-21.00-33.00min；流速为1ml/min，见图4。COP-2经三氟乙酸完全水解，样品只含一种单糖，即果糖（见图5）。IR中936cm-1及817 cm-1两个果聚糖特有的吸收峰（见图6），也证明该多糖为一果聚糖。从13C NMR中102-104ppm异头碳信号证明该多糖为β构型，这种呋喃型的连接方式有13C及1HNMR中得到进一步证实。上述分析证明：COP-2为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连。三、党参均一多糖COP-2对免疫功能的作用研究：实验1：COP-2对免疫功能的作用研究实验材料及仪器动物：昆明种小鼠，清洁级，体重20-22 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。饲养环境安静，室温22-23 °C，光照/暗时间为12/12 h循环，各组实验小鼠自由进食、饮水。药物：COP-2阳性药物：环磷酰胺(粉针剂0.2g)，江苏恒瑞医药股份有限公司。实验仪器：CKX-41型倒置显微镜（奥林巴斯（日本）公司）。各实验预设组给药方案选取48只健康雄性昆明种小鼠，分为3组，分别为空白组，模型组，COP-2多糖组。给药方案如下：模型组：组小鼠采用腹腔注射环磷酰胺（CTX）粉针剂100mg/kg的剂量，连续腹腔注射3d诱导免疫抑制小鼠模型，其中空白组小鼠不注射CTX诱导。空白组：造模后，给予蒸馏水灌胃，灌胃体积与其他组别体积相同；COP-2剂量组：造模后，给予600mg/kg的党参多糖灌胃。小鼠胸腺、脾脏指数的计算取血后的小鼠牵拉后脱颈椎处死，分别取小鼠脏器后，用生理盐水冲洗脏器上血液，剔除干净胆囊、脂肪团等，用滤纸吸干血迹后称重，记录小鼠体重、脾脏、胸腺，计算小鼠的脏器指数：胸腺指数=（胸腺重量/小鼠体重）×10脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）×10数据分析实验数据按完全随机对照设计的要求收集整理，所有数据以 ± s表示，全部数据采用SPSS17.0软件进行ONE-WAY ANOVA处理，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett，T3法，以P<0.05时认为有统计学意义。取材后脏器整理，按照公式计算小鼠的胸腺指数和脾脏指数。统计学结果显示模型组小鼠的脏器指数明显低于空白组小鼠(P＜0.01)，两组党参多糖组分中，COP-2组的的脏器指标均明显高于模型组(P＜0.01)，对比A、B两组间的脏器指标，数据分析显示未见明显差异见图7。具体数据指标见表1数据表：实验2 ：小鼠骨髓微核实验取小鼠股骨头，剥离干净后，用1640无血清培养基充分冲洗股骨头中骨髓，收集含有小鼠骨髓的悬液，1000r/min离心，弃去上清液，用下层骨髓制作骨髓涂片。对涂片后的小鼠骨髓涂片进行Giemsa染色法染色。（Giemsa染液配制：取1g染料，加入20ml丙三醇溶液，在研钵中充分研磨2h，研磨后加入50mL甲醇溶液后，静置一周，过滤收集滤液为Giemsa原液。原液按照1:50V/V加入pH=6.8的磷酸盐缓冲液，得到Giemsa染色液）对染色后的骨髓涂片进行镜下观察，并对染色后的10000个骨髓嗜多染红细胞中微核数目进行计数统计。数据分析实验数据按完全随机对照设计的要求收集整理，所有数据以±s表示，全部数据采用SPSS17本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种党参均一多糖COP‑2，其特征在于：该多糖是分子量为9900的β‑D‑果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，该多糖的还原端与α‑D‑Glc相连。

【技术特征摘要】
1.一种党参均一多糖COP-2，其特征在于：该多糖是分子量为9900的β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，该多糖的还原端与α-D-Glc相连。2.一种如权利要求1所述的党参均一多糖COP-2的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将干燥党参块根，剪切成1cm小节，用6-10重量倍、且质量浓度为60-80％的乙醇回流3次，乙醇液弃之，将药渣水用6-10重量倍的蒸馏水提2-3次，将水提液减压浓缩至0.5-1.0g/ml，加入质量浓度为85-95％乙醇至含醇量达80％，静置过夜，倾去上清液，沉淀重复醇沉1次，冷冻干燥，得淡黄色党参粗多糖粉末；2）将党参粗多糖粉末完全溶解于蒸馏水中，获得多糖溶液，将多糖溶液在4000rpm条件下离心10min，弃去不溶物，留取上清液备用；3）将上清液上Sephacryl S-200HR，以0.2M氯化钠作为洗脱液...

【专利技术属性】
技术研发人员：余兰，刘章泉，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52