聚乙二醇修饰蛋白及修饰产物纯化的方法技术

本发明专利技术公开了一种PEG修饰蛋白及纯化的工艺过程，包括：将蛋白质溶于缓冲溶液1中，将蛋白溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白等步骤。和传统的PEG修饰及纯化工艺比较，本发明专利技术提供的工艺步骤更简单，产物收率更高，且对蛋白的活性影响较小。

Polyethylene glycol modified protein and method for purifying modified product

The invention discloses a PEG modified protein and purification process, including: the protein dissolved in buffer solution 1, the protein solution inhalation of ion exchange chromatography, eluted with buffer balance, elution buffer, protein elution steps. Compared with the traditional PEG modification and purification process, the invention has the advantages of simpler process steps, higher product yield and less influence on the protein activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及聚乙二醇的修饰和纯化方法，特别是聚乙二醇修饰蛋白和修饰产物纯化的方法和应用，更具体的是聚乙二醇修饰和纯化门冬酰胺酶的方法。
技术介绍
自1970s聚乙二醇(PEG)修饰技术产生以来，在过去的三十年里，许多蛋白质被PEG改性，用于药物开发、反应催化、药物传递等等，取得了显著的社会效益和经济效益。国际上的知名生物公司积极推进PEG修饰蛋白质、多肽类药物的技术，已经上市的产品如1990年，PEG修饰腺苷脱氨酶用于治疗缺陷性疾病(Enzon公司的)上市，不仅减轻了药物的免疫原性和抗原性而且皮下注射其半衰期从几分钟延长到28h左右，标志着聚乙二醇修饰物的成功应用。随后，PEG修饰天冬氨酸酶(通常被称为门冬酰胺酶，L-天冬酰胺酶，L-门冬酰胺酶，或天门冬酰胺酶)用于治疗白血病和黑色素瘤(Enzon公司的)；PEG修饰人生长激素受体拮抗剂用于治疗肢端肥大症和超常增生症(Pfizer公司的PEG)；PEG修饰α干扰素用于治疗丙型肝炎(Hoffman-LaRoche公司的和Schering-Plough/Enzon公司的PEG；PEG修饰粒细胞集落刺激因子用于治疗化疗患者的嗜中性白细胞缺少症(Amgen公司的)；PEG修饰的血管内皮(细胞)生长因子适配子(PEG-anti-VEGFaptamer,OSIPharmaceuticals),用于治疗老年黄斑变性病。另外，2007年批准PEG修饰的红细胞受体激动剂(Hoffman-LaRoche)，用于治疗成人肾衰竭造成的贫血，其2009年销售额比2008年增长252％，达到1.79亿瑞士法郎，约合1.55亿美元；2008年，PEG化抗体片段修饰物(比利时UCB公司)，是anti-TNFαFab’的修饰物，用于治疗Crohn’s疾病；2009年批准用于风湿及类风湿关节炎的治疗。截至到2007年，上市聚乙二醇药物的年销售总额超过58亿美元。蛋白的聚乙二醇修饰反应步骤一般包括：样品缓冲液置换，加入修饰剂进行反应，目的修饰产物纯化，共三个步骤。由于蛋白的长期保存，一般需要在特定缓冲液中或者做成冻干粉，但用于长期保存蛋白的缓冲液或者是加入了辅料的蛋白冻干粉都不适合直接进行聚乙二醇修饰反应。因此，在进行蛋白的聚乙二醇修饰反应时，首先需要对目标蛋白进行缓冲液置换，把蛋白置换到适当的缓冲液中以便进行后续的修饰反应。目前最常见的处理方法就是通过超滤的方法来进行。这种方法的样品处理量较大，比较适合生产放大。但是由于超滤过程中，蠕动泵剪切力的影响，会对蛋白有一定的破坏影响，对于一些稳定性较差的蛋白，这种破坏作用更明显，导致蛋白活性显著下降。另外一种方法是用脱盐柱对样品进行缓冲液置换，这种方法相对温和，不会对蛋白造成破坏，但这种方法的处理量小，不适合实际的生产放大。另外通过透析的方法也可以达到缓冲液置换的目的，但这种方法由于耗时较长，处理量不大，需要配置大量的缓冲液，因此同样不适合实际的生产过程。另外在聚乙二醇修饰反应结束后，目标修饰物、副产物、未修饰的蛋白和未反应的PEG以及其它一些小分子组分混合在一起，必须通过纯化把目标修饰物从混合物中纯化出来。目前最常用的纯化方法是离子交换层析以及凝胶过滤层析。离子交换层析由于其处理量大而使用最为广泛，但目前实际生产制备过程中由于目的产物的纯度达不到要求，经常需要再进行一步凝胶过滤层析。由于每一步纯化步骤都会有目地产物损失，并且有一定的人力、时间和财力的成本，因此目的产物的纯化方法在满足产品质量要求的前提下，纯化步骤越少成本越低。目前针对L-门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰研究已有很多。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar(Enzoninc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。国内相关的专利主要有两个，分别是连云港新阳医药有限公司的“聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法”(申请号02149328.6)，和上海医药工业研究院的“聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶”(申请号200610027026.0)。其中连云港新阳医药有限公司的专利中所采用的修饰方法是两步反应法，首先用分子量较小的PEG修饰剂进行修饰，然后再用分子量较大的PEG修饰剂进行二次修饰。这种修饰方法步骤繁多，纯化方法复杂，收率较低，不适合进行生产放大。而上海医药工业研究院的专利中使用的PEG修饰剂与门冬酰胺酶结合后。纯化需要首先用离子交换进行纯化，然后进行超滤浓缩，浓缩过后再用凝胶过滤进行纯化，步骤较多，也存在产物收率较低的情况。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术中的上述技术问题，本专利技术旨在提供一种简单高效的PEG修饰、纯化蛋白质的方法及其在制备PEG修饰L-门冬酰胺酶中的应用。技术方案：本专利技术的第一目的是提供一种聚乙二醇修饰蛋白质的方法，包括蛋白的缓冲液置换、加入PEG修饰剂进行修饰反应，所述缓冲液置换是通过层析一步完成的。进一步地，所述缓冲液置换的通过离子交换色谱层析法进行，其中所采用的洗脱缓冲液同时也是PEG修饰反应步骤中的修饰缓冲液。进一步地，所述缓冲液置换的离子交换色谱层析法中所采用的洗脱缓冲液为pH为7.5-8.5的磷酸缓冲液或硼酸-磷酸缓冲液。优选的，其中还含有0.15-0.25M氯化钠。更进一步地，所述缓冲液置换的离子交换色谱层析法中所采用的洗脱缓冲液为pH为8.5的硼酸-磷酸缓冲液，其中含有0.2M氯化钠。进一步地，还包括目的修饰产物纯化，所述纯化也是通过层析完成的，作为优选，其中洗脱缓冲液是修饰产物最终的制剂缓冲液。更优选的是，所述洗脱缓冲液是pH为7.0-7.2磷酸缓冲液。更优选的，其中含有0.10M-0.15M氯化钠。进一步地，由于本专利技术修饰反应的修饰率高，纯化步骤只要通过一步层析。本专利技术的第二目的是提供一种上述的制备方法在门冬酰胺酶(ASP)的聚乙二醇修饰中的应用。所述聚乙二醇化的门冬酰胺酶的制备方法包括如下步骤：第一步：缓冲液置换把门冬酰胺酶原料药溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液同时为下一步修饰反应中的修饰缓冲液；第二步：修饰反应及修饰产物纯化将第一步中收集洗脱峰的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:10-1：200的摩尔比进行反应，在4℃-37℃下反应1-24h；其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为5-40mg/ml；反应结束后再次用离子交换色谱层析进行纯化。所述聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其中一分子门本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚乙二醇修饰蛋白质方法，包括蛋白的缓冲液置换、加入PEG修饰剂进行修饰反应，其特征在于所述缓冲液置换是通过层析一步完成的。

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇修饰蛋白质方法，包括蛋白的缓冲液置换、加入PEG修饰剂进行修饰
反应，其特征在于所述缓冲液置换是通过层析一步完成的。
2.如权利要求1所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于，所述缓冲液置换通过
离子交换色谱层析法进行，其中所采用的洗脱缓冲液同时也是PEG修饰反应步骤中的修饰缓
冲液。
3.如权利要求2所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于，所述缓冲液置换的离
子交换色谱层析法中所采用的洗脱缓冲液为pH为7.5-8.5的磷酸缓冲液或硼酸-磷酸缓冲液。
4.如权利要求2所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于，所述缓冲液置换的离
子交换色谱层析法中所采用的洗脱缓冲液为pH为8.5的硼酸-磷酸缓冲液。
5.如权利要求1所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于还包括目的修饰产物的
纯化，所述纯化是通过层析一步完成的。
6.如权利要求4所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于纯化采用交换色谱层析
法，其中洗脱缓冲液是修饰产物最终的制剂缓冲液。
7.如权利要求4所述的蛋白质聚乙二醇修饰的方法，其特征在于层析纯化中洗脱缓冲液
是pH为7.0-7.2的磷酸缓冲液。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰中的应用。
9.聚乙二醇化的门冬酰胺酶的制备方法，包括如下步骤：
第一步：缓冲液置换
把门冬酰胺酶原料药溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，
收集洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液同时为下步修饰反应中的修饰缓冲液；
第二步：修饰反应及修饰产物纯化
将第一步中收集洗脱峰的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:10-1：200的摩
尔比进行反应，在4℃-37℃下反应1-24h；其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为<...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王俊，吴鼎龙，闻兴元，王和，徐春林，陈一飞，王耀方，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32