本文涉及UPLC‑MS/MS法测定人血浆中莎巴比星及其代谢产物M3的血药浓度。本文提供了通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法，其中所述方法采用甲酸水‑乙腈作为流动相进行。本文提供的莎巴比星和代谢物M3检测方法灵敏度高、重复性好，可以满足莎巴比星治疗恶性实体瘤的临床药代动力学生物样品定量分析的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测人血浆中药物的浓度的方法。具体而言，本专利技术涉及通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法。
技术介绍
引言
莎巴比星属于蒽环类药物，为意大利美纳里尼制药公司通过延长和修饰碳水化合物而合成的新型药物，具有更强的药效以及更低的心脏毒性[11,12]。动物实验表明，莎巴比星对不同组织来源肿瘤的抑制作用比它的同类药物多柔比星更强[13]。而且欧洲的I、II期临床试验已初步验证莎巴比星在人体的安全性和耐受性，证明莎巴比星在卵巢癌和肺癌中具有较好的疗效[11]。本研究旨在建立灵敏、快捷的超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)方法检测人血浆的莎巴比星和代谢物M3的血药浓度，为莎巴比星治疗难治或复发的SCLC的I期临床药代动力学研究提供支持。
检测血液或其他生物样本中的药物浓度是药动学、药效学研究和临床治疗的基础。用于检测血浆药物浓度的方法应当具备高灵敏度、能够快速获得结果和能够使用少量样品进行。然而，由于血液中存在包括磷脂、蛋白等多种组份，检测易受基质效应等各种因素的影响。如何最大可能减少基质效应，尽可能获得血液中药物的准确浓度，是本领域必须进行深入研究的课题。
HPLC法是目前检测血药浓度常用的方法，应用范围广泛。但是，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低，并不适用于高通量的生物样品分析。
超高效液相色谱质谱联用(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC-MS/MS)法提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。然而，UPLC-MS/MS对流动相，色谱柱，样品前处理，质谱接口，数据采集系统都提出了特别的要求。尽管对转换方法进行了一些研究，传统的高效液相色谱HPLC的条件不能直接应用于UPLC-MS/MS，需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择、质谱条件设置等各项条件进行大量试验，才能实现UPLC-MS/MS快速检测分析。例如，周新等人的研究(HPLC与UPLC色谱条件转换方法研究，分析试验室，第27卷第4期，2008年4月)表明直接将HPLC条件应用于UPLC，不能达到对待测物质分离分析的目的；而且质谱检测与色谱检测不同，对于流动相组成、流速等多种方面需要额外的注意，因此对实验条件包括例如流动相选择等进行具体深入研究才能获得分离状况良好的UPLC-MS/MS方法。
目前对于心脏毒性的机制研究显示，C13醇代谢产物可通过影响心肌细胞Ca2+交换和能力代谢而损伤心肌细胞。并且相对于原形药，C13醇代谢产物在心肌细胞内蓄积时间更长，其蓄积浓度与心脏毒性具有相关性[15]。因此对于莎巴比星的C13醇代谢产物M3的药代动力学研究对预测莎巴比星的心脏毒性具有重要价值。建立莎巴比星和代谢物M3血药浓度的检测方法对于莎巴比星的临床研究具有重要意义。目前尚未见有用于测定人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法的报道。已经报道方法不能同时检测C13醇代谢产物M3，灵敏度较低，不适用于临床药代动力学研究的大批量的样本检测。
本领域急需能够用于同时检测人血浆中莎巴比星和M3的浓度的快速、灵敏的方法。
技术实现思路
专利技术人已经建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱(ultrahighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS)技术检测人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度。本专利技术的方法具有的优点包括例如样本处理简单、快捷、灵敏度高等。鉴于C13醇代谢产物相对于原形药在心肌细胞内蓄积时间更长，其蓄积浓度与心脏毒性具有相关性，对于莎巴比星的C13醇代谢产物M3的药代动力学研究对预测莎巴比星的心脏毒性具有重要价值。本专利技术实现了对人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的同时检测，具有重要意义。
在一些实施方案中，本专利技术提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法，其中所述方法采用甲酸水-乙腈作为流动相进行。专利技术人已经发现采用甲酸水-乙腈作为流动相进行分析时，洗脱能够快速、充分分离待测物质，获得良好的峰形，基线噪音低。
在一些实施方案中，本专利技术的方法采用的甲酸水-乙腈流动相的体积比选自以下范围：甲酸水:乙腈(90/10,v/v)-甲酸水:乙腈(10/90,v/v)，甲酸水:乙腈(80/20,v/v)-甲酸水:乙腈(20/80,v/v)，甲酸水:乙腈(70/30,v/v)-甲酸水:乙腈(30/70,v/v)，甲酸水:乙腈(60/40,v/v)-甲酸水:乙腈(40/60,v/v)。
在一些实施方案中，本专利技术的方法中采用的流动相为0.1％甲酸水-乙腈。在一些实施方案中，所述流动相采用上述体积比进行。在一些实施方案中，本专利技术的方法中采用梯度洗脱进行。在一些实施方案中，本专利技术的方法采用下述梯度洗脱进行A：0.1％甲酸水；B：乙腈，洗脱梯度为：0～0.5min：10％B；0.51～2.8min：28％B；2.81～3.8min：90％B，3.81～4.5min：10％B。在一些实施方案中，洗脱流速设为0.3ml·min-1。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性，向流动相中加入改性剂等。已经观察到采用所述流动相进行洗脱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中，本专利技术的方法采用ACQUITYUPLCBEHShieldRP18(100mm×2.1mm,1.7μm)作为分析柱进行。在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。在本专利技术中，专利技术人发现ACQUITYUPLCBEHShieldRP18(100mm×2.1mm,1.7μm)能够实现莎巴比星和C13醇代谢产物M3良好分离和峰型，但是洗脱时间适当。因此，已经观察到采用ACQUITYUPLCBEHShieldRP18(100mm×2.1mm,1.7μm)作为分析柱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中，本专利技术的方法可以采用多柔比星为内标进行。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。在一些实施方案中，专利技术人已经显示采用多柔比星作为内标能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。
血浆样品的前处理过程是UPLC-MS/MS中获得高灵敏度的关键。在本专利技术中，可采用蛋白沉淀法、固相萃取法和液液萃取法对血浆样品进行处理。然而，本专利技术的方法优选采用液液萃取法进行血浆样本的预处理。本专利技术提供的数据表明采用液液萃取法简便、灵敏，液液萃取法完全满足试验中对测定的要求。在本专利技术中，可以通过例如氯仿异丙醇进行萃取。氯仿和异丙醇的体积比没有特本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定人血浆中莎巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法，其中所述方法采用甲酸水‑乙腈作为流动相进行。
【技术特征摘要】
1.通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中莎
巴比星和C13醇代谢产物M3的浓度的方法，其中所述方法采用甲酸水-
乙腈作为流动相进行。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法采用的甲酸水-乙腈流动相
的体积比选自以下范围：甲酸水:乙腈(90/10,v/v)-甲酸水:乙腈(10/90,v/v)，
甲酸水:乙腈(80/20,v/v)-甲酸水:乙腈(20/80,v/v)，甲酸水:乙腈(70/30,v/v)-甲
酸水:乙腈(30/70,v/v)，甲酸水:乙腈(60/40,v/v)-甲酸水:乙腈(40/60,v/v)。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法采用梯度洗脱进行。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法采用多柔比星为
内标进行。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中待测人血浆样品通过液液萃取
法进行前处理。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述流动相采...
【专利技术属性】
技术研发人员：石远凯，韩晓红，张妍，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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