一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用。该真菌为子囊菌门、子囊菌纲、粪壳亚纲、粪壳目、毛壳科、毛壳属、球毛壳菌；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCC No.12979。本发明专利技术首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌，该菌次级代谢产物对软腐病欧文氏菌和青枯病茄科雷尔氏菌具有较好的抑制作用。本发明专利技术所述的制备香椿内生真菌TS8次级代谢产物的方法简单易行，成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用。
技术介绍
2014年我国果蔬年产量超过9.4亿吨。果蔬已成为继粮食之后的第二和第三大产业，且占全球市场的比重均在50%以上，并呈逐渐升高趋势。软腐病是果蔬类农业生产上最常见的一种细菌性病害，有关资料显示我国果蔬流通腐损率高达20-30%，每年造成经济损失高达1000多亿元，严重影响果蔬的产量和质量，给广大生产者和经营者造成巨大的经济损失。一直以来，化学农药是植物病虫害防治的主要手段，但目前能够有效防治果蔬软腐病害的药剂仍然较少，国内外对该病害的防治主要采用链霉素、春雷霉素等农用抗生素类制剂以及噻菌铜、噻枯唑等铜化学制剂两大类。但此类化学药剂往往存在高残留、高毒性以及环境污染等问题，对人类安全也存在隐患，许多品种已被禁用。另外化学药剂还容易产生病原菌的抗药性，影响防治效果。相对而言，植物及微生物源类似“农药”的活性物质具有选择性高、低毒、易降解、不易产生抗性等优点，尤其是在人们保护环境、崇尚自然以及关注食品安全等的新常态下，加强针对果蔬病虫害防治的新型植物及微生物源活性物质的研究和开发，对果蔬产业健康持续发展和人类健康均具有重要意义。然而由于植物体内天然活性物质含量较低，提取工艺复杂，以及植物资源往往受地理环境和生态条件等因素的影响，所以从植物中开发天然活性物质也具有一定的局限性。根据共生理论，植物内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，同时植物内生真菌作为微生物，具有生长速度快、发酵生产周期短、易于工业化发酵等特点，从而使植物内生真菌成为寻找和发现各种天然生物活性物质的新资源。许多源于植物内生真菌的次生代谢产物被鉴定出具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、杀虫以及酶抑制剂等多种生物学活性。植物内生真菌所产生的结构新颖、活性多样的化合物为新型抗真菌药物的发现提供了重要的先导化合物和新的药物作用靶点，成为天然活性产物和新药开发的重要来源。
技术实现思路
为克服现有果蔬软腐病治疗难题，本专利技术的目的旨在提供一种香椿内生真菌TS8及其次级代谢产物、制备方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种香椿内生真菌TS8，该真菌为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、球毛壳菌Chaetomiumglobosum；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月30日，保藏号：CGMCCNo.12979，分类命名：球毛壳菌Chaetomiumglobosum。本专利技术提供了两种制备香椿内生真菌56-50的次级代谢产物的方法，具体如下：方法一，步骤如下：（1）菌株发酵：将保藏号为CGMCCNo.12979的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm摇床发酵培养6-8d；（2）菌株次级代谢产物的制备：将步骤（1）所得菌株TS8的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌TS8的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对菌丝体进行萃取时，乙酸乙酯的用量以浸泡住菌丝体为准。方法二，步骤如下：（1）菌株发酵：将保藏号为CGMCCNo.12979的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，室温静置发酵培养25-30d；（2）菌株次级代谢产物的制备：将步骤（1）所得菌株TS8的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，合并萃取液，真空浓缩至干，得到发酵液的乙酸乙酯层萃取物；菌丝体用80v%的丙酮水溶液浸泡提取，反复提取数次，合并提取液，真空浓缩至不含丙酮后，再用等体积的乙酸乙酯萃取，重复萃取数次，然后合并萃取液并且真空浓缩至干，得到菌丝体的乙酸乙酯层萃取物；最后合并发酵液与菌丝体的乙酸乙酯层萃取物，即得香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。利用上述两种制备方法制备的香椿内生真菌TS8的次级代谢产物。所述香椿内生真菌TS8的次级代谢产物在降解软腐病欧文氏菌和/或青枯病茄科雷尔氏菌中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术首次从香椿植物茎中分离得到一株内生真菌TS8(Chaetomiumglobosum)，该菌次级代谢产物对软腐病欧文氏菌和青枯病茄科雷尔氏菌具有较好的抑制作用；（2）所述的制备香椿内生真菌TS8(Chaetomiumglobosum)次级代谢产物的方法简单易行，成本低。附图说明图1为实施例1香椿内生真菌TS8菌株形态特征，其中a为菌落正面形态，b为菌落反面形态，c、d分别为菌丝（×20）及（×100）形态。图2为实施例1香椿内生真菌TS8的18SrDNA基因片段扩增图谱，其中1--18SrDNA基因片段扩增产物，2为DNALadderMixMarker。图3为实施例1香椿内生真菌TS8的ITSrDNA基因片段扩增图谱，1--ITSrDNA基因片段扩增产物，2为DNALadderMixMarker。图4为实施例1香椿内生真菌TS8菌株基于18S基因序列构建的系统进化树。图5为实施例1香椿内生真菌TS8菌株基于ITS基因序列构建的系统进化树。具体实施方式下面结合具体实施例进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施例的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中：供试香椿材料：采自河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地。供试菌株：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的欧文氏菌(Erwiniasp)ACCC02203和茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)ACCC01474。PDA平板培养基和/或PDA斜面培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂2%，余量为水，pH6.0；PDA液体发酵培养基的重量百分比组成为：土豆20%、葡萄糖1%、麦芽糖2%、甘露醇2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、味精0.5%，余量为水，pH6.0；营养肉汁培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl0.5%，余量为水，pH7.0。营养肉汁琼脂培养基的重量百分比组成为：蛋白胨1%，牛肉提取物0.3%，NaCl0.5%，琼脂2%，余量为水，pH7.0。实施例11.香椿内生真菌的分离与筛选在无菌操作条件下，将香椿茎在75v%乙醇中浸泡1min，取出后在有效氯3wt%次氯酸钠溶液中浸泡1min，再在75v%乙醇中浸泡30s，然后用无菌水漂洗3次，无菌吸水纸干燥；用灭菌后的剪刀将其剪成0.5cm左右的小块，放在PDA平板培养基上，每板4根，于2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香椿内生真菌TS8，其特征在于：该真菌为子囊菌门

【技术特征摘要】
1.一种香椿内生真菌TS8，其特征在于：该真菌为子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳亚纲Sordariomycetidae、粪壳目Sordariales、毛壳科Chaetomiaceae、毛壳属Chaetomium、球毛壳菌Chaetomiumglobosum，并于2016年9月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.12979。2.一种制备香椿内生真菌TS8的次级代谢产物的方法，其特征在于，步骤如下：（1）菌株发酵：将保藏号为CGMCCNo.12979的香椿内生真菌TS8接种到PDA平板培养基上，25-28℃活化培养3-5d，然后接种到盛有PDA液体发酵培养基的锥形三角瓶中，25-28℃、150-180rpm摇床发酵培养6-8d；（2）菌株次级代谢产物的制备：将步骤（1）所得菌株TS8的发酵培养液先搅碎，再过滤，得到发酵液和菌丝体；然后采用乙酸乙酯分别对发酵液和菌丝体进行萃取，重复萃取数次，合并萃取液，浓缩制备得到香椿内生真菌TS8的次级代谢产物；其中，对发酵液进行萃取时，乙酸乙酯的用量与发酵液等体积；对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王赵改，王晓敏，张乐，史冠莹，赵守涣，赵洪源，杨慧，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41