基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法技术

本发明专利技术提供了一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于ITO电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光电化学信号的降低，实现了检测Pb2+的光电化学检测。本发明专利技术提供的ITO电极DNA生物传感器制备简单、成本低、反应条件温和，响应速度快，检测方便，周期短，稳定性高，重现性好。此外，该光电化学传感器对Pb2+具有高选择性、高灵敏度等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析化学和光电化学传感
，具体地说，涉及一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法。
技术介绍
重金属是环境体系中一类重要的污染物，具有难降解、毒性强、生物累积性等特点，对生态系统及人类健康具有严重的危害，因此对重金属离子的快速、简单、灵敏检测具有重要意义。传统的重金属离子分析方法主要是采用原子荧光、原子发射光谱法、ICP-AES/MS等，这些方法具有操作复杂、仪器设备昂贵、检测费用高、难于实现在线分析等缺点。随着生物传感技术的发展，应用生物传感法对有毒重金属离子的检测已成为研究热点之一。与酶、微生物、免疫生物传感法相比，DNA生物传感法具有识别层稳定，特异性识别目标小分子，受环境干扰和限制少，且易于合成或再生以供重复利用等优点，诸多优势使电化学DNA传感器作为一种新型的检测技术用于环境监测领域。铅离子作为“优先管理有害物质名单”上的重要金属离子，易对人体及环境产生毒害影响而备受人们关注。如今发展迅速的电化学、光电化学和光学传感技术，如基于荧光探针、金纳米粒子、DNA酶、半导体量子点和碳纳米管等生物传感方法，因具有操作简单、响应快速、分析成本低等优点，逐渐被广泛应用于Pb2+的检测。Li等在研究中发现，Pb2+可以和富含G碱基的DNA链发生作用生成Pb2+-DNA四联体结构，从而造成双链DNA的解链，在此基础上以锌卟啉为荧光探针，设计了荧光传感器，基于Pb2+引起DNA构型发生改变引起的荧光信号的变化，实现了对Pb2+的选择性检测。然而上述荧光方法仍然存在一定不足之处，如存在较高的背景信号干扰和较低的灵敏度等，因而在实际环境检测中受到多方面因素的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的基于光电化学DNA生物传感器的铅离子检测方法，利用Pb2+诱导ITO电极表面DNA构型发生变化，降低了DNA与Ru(bpy)2(dppz)2+光电化学信号探针分子的作用，从而实现对Pb2+的检测。所述方法包括以下步骤：1)ITO电极的制备：将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃(优选150～450℃)马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后切割成0.5cm×3cm玻璃片(优选用玻璃刀切割)，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；2)DNA溶液的配制：将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃(优选85℃)水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；3)DNA修饰ITO电极的制备：将0.1～5mg/ml的PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵)溶液涂于步骤1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗(优选洗三次)，氮气吹干；将步骤2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；4)Pb2+的光电化学检测：将1～50μMRu(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗(优选洗三次)，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极置于5-50mM(优选20mM)草酸缓冲液的光电化学测定池中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，形成三电极测定体系，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，进行循环伏安扫描，测定光电流强度；同理，将不同浓度的Pb2+溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，连接电化学工作站进行循环伏安扫描，测定光电流强度，实现对Pb2+的测定。本专利技术适体DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述Tris-HClO4缓冲液的pH值7.4，浓度为20mM。基于上述检测方法，本专利技术提供一种DNA修饰ITO电极，所述DNA修饰ITO电极的制备方法包括以下步骤：(1)将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇等清洗(清洗5分钟)，最后用超纯水清洗干净并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后用玻璃刀切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；(2)将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃(优选85℃)水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；其中，所述DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；(3)将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤(1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；将步骤(2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极备用；(4)将1～50μMRu(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤(3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗三次，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极置于5-50mM(优选20mM)草酸缓冲液的光电化学测定池中，并与铂丝对电极、Ag/AgCl参比电极形成三电极测定体系，进行光电化学测定。本专利技术还提供所述的DNA修饰ITO电极在环境水样中铅离子检测中的应用。检测时，将DNA修饰ITO电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，并连接电化学工作站，通过电化学循环伏安法检测光电流强度，再将电流强度据换算为浓度数据。本专利技术进一步提供一种光电化学DNA生物传感器，所述传感器包括电化学工作站以及所述DNA修饰ITO电极(工作电极)，铂丝对电极，Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。本专利技术通过将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于ITO电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光电化学信号的降本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)ITO电极的制备：将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然冷却后切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；2)DNA溶液的配制：将固体DNA样品用Tris‑HClO4缓冲液溶解，置于60‑95℃水浴锅中5～10min，然后自然冷却至室温，备用；3)DNA修饰ITO电极的制备：将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤1)制备的修饰有SnO2的ITO电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗，氮气吹干；将步骤2)配制的DNA溶液用Tris‑HClO4缓冲液稀释至2μM，取适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极，备用；4)Pb2+的光电化学检测：将1～50μM Ru(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤3)制备的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗，氮气吹干；然后将上述处理的DNA修饰ITO电极作为工作电极，置于5‑50mM草酸缓冲液的光电化学测定池中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，形成三电极测定体系，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，进行循环伏安扫描，测定光电流强度；将不同浓度的Pb2+溶液滴于上述处理的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，进行循环伏安扫描，测定光电流强度，实现对Pb2+的测定。...

【技术特征摘要】
1.基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法，其特征在
于，包括以下步骤：
1)ITO电极的制备：
将ITO玻璃电极依次用洗涤剂、丙酮、异丙醇清洗，最后用超纯
水清洗并于烘箱中烘干；将浓度1～20％的SnO2纳米溶胶旋涂到ITO导
电玻璃表面，待自然风干后，于50～450℃马弗炉中煅烧0.5～5h，自然
冷却后切割成0.5cm×3cm玻璃片，得到修饰有SnO2的ITO电极备用；
2)DNA溶液的配制：
将固体DNA样品用Tris-HClO4缓冲液溶解，置于60-95℃水浴锅中
5～10min，然后自然冷却至室温，备用；
3)DNA修饰ITO电极的制备：
将0.1～5mg/ml的PDDA溶液涂于步骤1)制备的修饰有SnO2的ITO
电极表面，在湿度恒定条件下孵育1～12h，然后用超纯水清洗，氮气
吹干；将步骤2)配制的DNA溶液用Tris-HClO4缓冲液稀释至2μM，取
适量涂于上述处理电极表面，在湿度恒定条件下孵育2～8h，用超纯水
清洗、氮气吹干，得到DNA修饰ITO电极，备用；
4)Pb2+的光电化学检测：
将1～50μMRu(bpy)2(dppz)2+探针溶液滴于步骤3)制备的DNA修
饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，然后用超纯水清洗，氮气吹干；然后
将上述处理的DNA修饰ITO电极作为工作电极，置于5-50mM草酸缓
冲液的光电化学测定池中，以Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，
形成三电极测定体系，连接电化学工作站，在473nm蓝色光照射下，
进行循环伏安扫描，测定光电流强度；将不同浓度的Pb2+溶液滴于上
述处理的DNA修饰ITO电极表面，孵育0.5～6h，进行循环伏安扫描，
测定光电流强度，实现对Pb2+的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述DNA

\t的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)马弗炉
中煅烧温度为150～450℃。

【专利技术属性】
技术研发人员：梁刚，贾文珅，满燕，靳欣欣，潘立刚，
申请(专利权)人：北京农业质量标准与检测技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11