本发明专利技术涉及酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境中重金属镍方面的应用。所述酿酒酵母基因缺失菌株为酿酒酵母基因缺失菌株vps38、酿酒酵母基因缺失菌株vps25和酿酒酵母基因缺失菌株vps30。本发明专利技术提供的三株酿酒酵母基因缺失菌株可作为清除环境中重金属镍污染的原始菌株，还可对其进行进一步的基因改造，开发新型具有更高性能的菌株，以有效对重金属镍污染的环境进行治理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酿酒酵母基因缺失菌株及其应用，具体地说是酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境中重金属镍方面的应用，属于环境治理
技术介绍
过渡金属中的铁，铜，锌，钙，锰，钴和镍是细胞的重要营养物质，能为很多酶和其它细胞成分提供生化活性和结构基础。另一方面，这些金属的过量累积会导致细胞毒性。生物体形成了多种调节胞内稳态的机制以避免毒性效应。胞内稳态的打破会导致许多人类疾病，包括癌症，贫血症以及阿尔茨海默症等神经退行性疾病。镍精炼、电镀、焊接等工业发展将人类暴露在高度镍污染的环境中，这可能造成多种病理学反应，比如皮肤过敏和癌症。做为最简单的真核生物，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）已被认证为研究金属离子稳态的有效模型。为了充分理解真核细胞中镍离子的效应，我们筛选酵母双倍体非必需基因缺失株文库，鉴定出与酵母细胞对镍离子敏感性相关的ESCRT和CWI途径的成份，为镍污染环境治理的工程奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供酿酒酵母基因缺失菌株及其在清除环境中重金属镍方面的应用，为构建用于镍污染环境治理的高效吸收和去除镍离子的酵母工程菌株奠定基础。按照本专利技术提供的技术方案：酿酒酵母基因缺失菌株vps38，其分类命名为Saccharomycescerevisiae，对应缺失的基因序列如SEQIDNO.1所示。酿酒酵母基因缺失菌株vps25，其分类命名为Saccharomycescerevisiae，对应缺失的基因序列如SEQIDNO.2所示。酿酒酵母基因缺失菌株vps30，其分类命名为Saccharomycescerevisiae，对应缺失的基因序列如SEQIDNO.3所示。酿酒酵母基因缺失菌株vps38、酿酒酵母基因缺失菌株vps38和酿酒酵母基因缺失菌株vps38在清除环境中重金属镍方面的应用。从美国InvitrogenInc公司购买同源的以BY4743为母菌株的4757个双基因缺失菌株出发，进行筛选：在添加600mM镍的YPD固体培养基上对菌株进行培养24-48小时，发现vps38、vps25、vps30三株菌株对镍耐受，进而对它们吸收镍能力进行测定，发现这三株菌株对镍的吸收能力提高。本专利技术具有如下优点：本专利技术提供了三株对重金属镍具有高吸收能力的酿酒酵母基因缺失菌株，可作为清除环境中重金属镍污染的原始菌株，还可对其进行进一步的基因改造，开发新型具有更高性能的菌株，以有效对重金属镍污染的环境进行治理。附图说明图1为实施例2中各酿酒酵母基因缺失菌株与野生型酿酒酵母菌株细胞内镍离子相对含量测定图。图中，Y坐标为各菌株细胞内镍离子相对含量，WT为野生型酿酒酵母菌株对照,它的胞内镍离子含量被主观定义为1。具体实施方式下面结合具体附图和实施例对本专利技术作进一步说明。如图所示：实施例1：菌株的筛选a、初步筛选：用已灭菌的384针接菌器将酿酒酵母缺失株文库（从美国InvitrogenInc公司购买）中的菌株影印到YPD+600mMNiSO4的培养基上，同时在YPD培养基上影印一次，作为对照。平板在30℃生化培养箱中培养2-3天后，拍照记录结果。通过与YPD培养基上菌株的生长结果对比，找出在YPD+600mMNiSO4培养基上有生长缺陷的菌株，既为镍离子耐受候选菌株。所述YPD培养基包括成分如下：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。b、通过倍比稀释（梯度稀释）方法对镍离子耐受候选菌株进行验证。从酿酒酵母缺失株文库中挑取镍离子耐受候选菌株，在YPD平板上活化后，接种到YPD液体培养基中过夜培养。将菌株过夜培养物用无菌水按10倍依次稀释至10的-4次方，然后从每个稀释浓度中取3mL分别点在YPD+600mMNiSO4和YPD平板上，30℃培养2天后观察生长情况，拍照，记录实验结果。与YPD平板上菌株的生长情况相比，确定对600mMNiSO4耐受的酿酒酵母基因缺失菌株。最终，从酿酒酵母缺失株文库中共发现22个基因缺失菌株对镍离子耐受，其中包括酿酒酵母基因缺失菌株vps38、酿酒酵母基因缺失菌株vps25和酿酒酵母基因缺失菌株vps30。实施例2：原子吸收法测定酿酒酵母基因缺失菌株的胞内镍离子浓度a、活化菌株：在YPD平板上活化酿酒酵母基因缺失菌株vps38、酿酒酵母基因缺失菌株vps25和酿酒酵母基因缺失菌株vps30。b、挑取单菌落（2mm直径的菌落一个），接于YPD液体培养基中过夜培养24h，基本达到饱和。c、将过夜培养物分别转接到新的50ml液体YPD+NiSO4（300μM）液体培养基中，使初始OD值达到0.2，30°C培养4h。d、样品处理：（1）将步骤c的最终培养物2000g离心2min。（2）用冰上预冷的10mMMgCl2溶液（含1Msorbitol，山梨糖醇）洗细胞三次，用重悬和离心的方法。（3）洗好的细胞重悬于5mL10mMMgCl2溶液中（不含sorbitol）。（4）取0.3mL步骤（3）所得的细胞重悬液，加入2.7ml步骤（2）所得的10mMMgCl2溶液，混匀后测OD660nm吸光度值；10mMMgCl2溶液做空白对照。（5）加浓H2SO4（10M）至终浓度0.5%（50mM），95°C水浴放置10min。（6）离心，取上清，用原子吸收光谱法测定相应金属离子浓度。经原子吸收法检测，结果表明酿酒酵母基因缺失菌株vps38、酿酒酵母基因缺失菌株vps25和酿酒酵母基因缺失菌株vps30吸收镍的能力与野生型酿酒酵母菌株相比都明显提高（参见图1）。<210>SEQIDNO:1<211>1320bases<212>DNA<213>（Saccharomycescerevisiae）vps38<400>1ATGAAACGGTTCTTACTCAGTCGAAGACAGAGACACCTTCGTATGATTTGCTTTCACAAT60ATAAGTCTCTTTAGAGCTAATGGTGACTCCAAATTGATCAAGGAATATGGTGATGGATTT120ATACCATGTTTCTTTATCTTGGAATCCATAAGAGGGGAGCTGCTTTATGTGAGCGAGGTA180CAATCAGGTTCTTTGCGTAAACTCTCTTTTCAGGAATTACCAAAACTAACTGGTGCATCT240ACTATGATTGTCCTAAAATTGGTAGGACTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
酿酒酵母基因缺失菌株vps38，其分类命名为Saccharomyces cerevisiae，对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.酿酒酵母基因缺失菌株vps38，其分类命名为Saccharomycescerevisiae，对应缺失
的基因序列如SEQIDNO.1所示。
2.酿酒酵母基因缺失菌株vps25，其分类命名为Saccharomycescerevisiae，对应缺失
的基因序列如SEQIDNO.2所示。
3.酿酒酵母基因缺失...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋伶活，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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