引物对、制备细胞周期因子Y的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了引物对、制备细胞周期因子Y的方法以及用于检测细胞周期因子Y抗体的试剂盒和方法，其中，引物对具有SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列。利用本发明专利技术的引物对扩增细胞周期因子Y的编码基因，进而合成细胞周期因子Y，并利用细胞周期因子Y包被试剂板得到固相载体，制备检测血清中细胞周期因子Y抗体试剂盒，或检测血清中细胞周期因子Y抗体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法，灵敏度高、准确性好、成本低，操作简单，可应用于血清和血浆中细胞周期因子Y抗体的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及抗体检测
，更具体地，涉及引物对、制备细胞周期因子Y的方法、用于检测细胞周期因子Y抗体的试剂盒和用于检测细胞周期因子Y抗体的方法。
技术介绍
CCNY又称CyclinY、cyc-Y、细胞周期因子Y、周期素盒蛋白1(cyclinboxprotein1)、周期素折叠蛋白1(cyclinfoldprotein1)或周期素盒携带蛋白1(cyclin-boxcarryingprotein1)，是近年来新发现的一种细胞周期蛋白，其编码基因ccny定位于10号染色体，全长3968bp，有10个外显子，9个内含子。CCNY蛋白含有341个氨基酸，分子量约为39KD。研究显示，CCNY基因水平的变化影响着细胞周期的进程，进一步影响着肿瘤细胞的增殖，迁移与侵袭能力，从而影响着肿瘤的发生、发展的进程。据最新的研究显示，CCNY不仅能够能促进脑胶质瘤细胞的增殖，CCNY还能促进直肠癌瘤细胞的粘附能力、细胞的迁移和侵袭能力，从而影响着直肠癌细胞的转移。细胞周期因子家族的其他成员例如CyclinB1，CyclinD，CyclinE等在肿瘤的相关研究中均呈现高表达的态势，并且在肿瘤患者血清中均检测出相应的抗体存在，而这些细胞周期素相应的抗体部分具有一定的辅助诊断价值，尤其是对肿瘤患者的早期辅助诊断，部分抗体具有作为肿瘤患者预后评价的重要参考意义。据最新的研究报道，CCNY抗体水平的高低可以用来预测非小细胞肺癌早期术后患者的生存期的长短；并且血清CCNY抗体水平的高低与非小细胞肺癌早期术后患者是否出现了癌症复发，转移等疾病进展存在着一定的联系。因此临床医生可以通过对血清CCNY抗体水平的监测，来预测疾病的发展进程，从而及早调整临床治疗手段和方法，提高肿瘤患者生活质量和延长肿瘤患者的生存时间。由于CCNY是新发现的周期因子，所以在其他肿瘤患者中关于血清CCNY抗体的研究还是空白。因此，细胞周期因子Y抗体的检测的临床应用价值有待研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种快速、简便和高效地检测细胞周期因子Y的试剂盒和方法。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种引物对。根据本专利技术的实施例，所述引物对具有SEQIDNO：1和2所示的核苷酸序列。由此，利用该引物对，可以高效、准确和快捷地实现对细胞周期因子Y编码基因的扩增。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种制备细胞周期因子Y的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：采用前述的引物对，扩增细胞周期因子Y编码基因；将所得到的细胞周期因子Y编码基因亚克隆至质粒中，以便获得重组质粒；利用所述重组质粒转化大肠杆菌，并对所得到的转化后的大肠杆菌进行培养，其中，在所述培养过程中通过添加IPTG诱导所述细胞周期因子Y的表达；以及纯化所述细胞周期因子Y。由此，利用本专利技术的前述引物进行基因扩增，扩增的准确度高、速度快，并且细胞周期因子Y重组表达的效率高。根据本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种用于检测细胞周期因子Y抗体的试剂盒，其特征在于，包括：固相载体，所述固相载体上携带有前述所制备的细胞周期因子；辣根酶标记抗体；辣根酶标记抗体稀释液；洗涤浓缩液；底物显色液；以及终止液。由此，利用本专利技术的试剂盒，可以快速，可靠和有效地对血清中CCNY抗体进行检测，与免疫组织化学相比较，本专利技术的方法检测的灵敏度高，成本低，所需设备简单，检测样本易获得，操作方便，易于临床推广。根据本专利技术的再一方面，本专利技术提供了一种用于检测细胞周期因子Y抗体的方法。该方法包括：(1)包被细胞周期因子Y至试剂板，4℃过夜后洗板，以便得到包被细胞周期因子Y的固相载体；(2)向所述包被细胞周期因子Y的固相载体中加入5％胎牛血清封闭液，4℃封闭过夜后洗板，以便得到封闭后的固相载体；(3)将识别细胞周期因子Y的多克隆抗体和待检测的血清进行梯度稀释，加入到所述封闭后的固相载体中，孵育后洗板；(4)向步骤(3)得到的固相载体中加入辣根酶标记抗体，孵育后洗板；(5)向步骤(4)得到的固相载体中加入底物显色液；(6)向步骤(5)得到的固相载体中加入终止液，终止反应，检测OD450的值，通过分析OD450值的大小，判断血清中细胞周期因子Y抗体浓度。由此，利用本专利技术的方法，可以快速，可靠和有效地对血清中CCNY抗体进行检测，与免疫组织化学相比较，本专利技术的方法检测的灵敏度高，成本低，所需设备简单，检测样本易获得，操作方便，易于临床推广。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术一个实施例的制备细胞周期因子Y的流程示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的检测血清中细胞周期因子Y抗体的方法流程图；图3显示了根据本专利技术一个实施例的试剂盒的多克隆抗体标准品的标准曲线示意图；图4显示了根据本专利技术一个实施例的凝胶电泳结果示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术而不是要求本专利技术必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。引物对和制备细胞周期因子Y的方法根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种引物对。根据本专利技术的实施例，该引物对具有SEQIDNO：1和2所示的核苷酸序列。由此，利用该引物对，可以高效、准确和快捷地实现对细胞周期因子Y编码基因的扩增。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种制备细胞周期因子Y的方法。参考图1，根据本专利技术的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：S100：扩增细胞周期因子Y编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQIDNO：1和2所示的核苷酸序列。
2.一种制备细胞周期因子Y的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1所述的引物对，扩增细胞周期因子Y编码基因；
将所得到的细胞周期因子Y编码基因亚克隆至质粒中，以便获得重组质粒；
利用所述重组质粒转化大肠杆菌，并对所得到的转化后的大肠杆菌进行培养，其中，在
所述培养过程中通过添加IPTG诱导所述细胞周期因子Y的表达；以及
纯化所述细胞周期因子Y。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用PCR扩增细胞周期因子Y编码基因，其中，反应体系：A549肺腺癌细胞的cDNA
2μl，2U/μlpfuDNA聚合酶1μl，10mMdNTP1μl、10mM上游引物和下游引物各1μl，10
×PCRbuffer5μl，补水至50μl；反应条件:热启动95℃5min；循环参数为：变性94℃30s、
退火温度62.5℃45s、延伸72℃1min共30个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应，以
便得到扩增后的细胞周期因子Y编码基因；
利用NcoⅠ/XhoⅠ酶切体系将所述扩增后的细胞周期因子Y编码基因双酶切后克隆至
pET30a(+)质粒中，得到重组质粒；
利用所述重组质粒转化入E.coliBL21大肠杆菌，并对转化后的大肠杆菌进行培养，当
所述转化后的大肠杆菌的培养液的OD600为0.6时，向所述转化后的大肠杆菌培养液中加
入IPTG，其中，IPTG的浓度为0.4mM/L，以便得到所述细胞周期因子Y，其中，所述细胞
周期因子Y是以组氨酸-细胞周期因子Y重组蛋白的形式存在；以及
利用镍离子亲和层析柱纯化所述细胞周期因子Y。
4.一种用于检测所述细胞周期因子Y抗体的试剂盒，其特征在于，包括：
固相载体，所述固相载体上携带有权利要求2或3所述的方法制备的所述细胞周期因子；
辣根酶标记抗体；
辣根酶标记抗体稀释液；
洗涤浓缩液；
底物显色液；以及
终止液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：
标准品，所述标准品为识别所述细胞周期因子Y的多克隆抗体；和
标准品稀释液，所述标准品稀释液的成份为：基于20ml所述标准品稀释液，含有
0.08-0.12g的NaCl，0.002-0.008g的KCl，0.002-0.008g的KH2PO4和0.02-0.5g的Na2HPO4。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳文涛，马丽，滕宇，张丽娜，顾勐，王玥，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京胸科医院，北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11