甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤药物领域，特别涉及甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。一种甜甙及其类似物的制备方法，通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点；和/或以ERK信号通路为药物靶点。甜甙及其类似物是以STAT3和/或以ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有非常好的抑制效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤药物领域，具体而言，涉及甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。
技术介绍
STAT3是信号转导和转录活化因子(STAT)家族重要的成员，在很多恶性的组织类型肿瘤中均呈现高表达，并在肿瘤发生进程中起促进作用。STAT3在接受非受体酪氨酸激酶、细胞因子以及生长因子等细胞外信号刺激后被磷酸化激活，形成磷酸化的STAT3(phosphorylatedSTAT3，P-STAT3)。P-STAT3会迅速移至细胞核内，与靶基因的启动子相结合，激活基因的转录，进而影响细胞的生长、增殖与凋亡。STAT3续激活可以导致细胞异常增殖与恶性转化，因而STAT3信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关。目前所研究的STAT3与多种人类肿瘤有关系，如结肠癌、胰腺癌、肺癌、淋巴癌等等。BuettnerR综述了STAT在癌肿中的干预作用以及细胞调控中的影响，探讨了STAT信号转导途径对的调控，王俊阁探讨STAT3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制，发现STAT3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物与细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)成员之间的平衡而调节喉癌细胞G1～S期转换。随着对STAT3信号通路的深入研究，STAT3在肿瘤发生发展过程中所起的作用越来越受到重视，以STAT3为靶点的治疗方法，抑制STAT3活化有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟新的途径。STAT3的活化通过磷酸化实现，细胞中STAT3的持续磷酸化会引起一系列的生物学效应，比如细胞的恶性增殖、抗凋亡，因此利用药物来抑制STAT3磷酸化是治疗癌症的重要的突破口。ERK1/2是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成员之一，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应，而p-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式，ERK1/2磷酸化后，进入细胞核作用于c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等转录因子，调节相关基因的转录，进而参与细胞生长、增殖、凋亡，该信号转导通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关。因此，靶向调控STAT3、ERK信号通路可以作为治疗肿瘤的重要途径。自然界是一个巨大的药物宝库，天然化合物具有结构新颖、多样的特点，是当前开发抗肿瘤药物以及药物先导分子的重要来源。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种甜甙及其类似物的制备方法，通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。本专利技术的第二目的在于提供甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，所述的甜甙及其类似物通过选择性抑制STAT3、ERK信号通路，诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡以实现抑制癌细胞增殖功效。甜甙是以罗汉果醇为前体，在糖基转移酶作用下发生糖基化而生成的三萜化合物。为了说明甜甙及其类似物的靶向抑癌效果，本专利技术以甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2单体举例来说明甜甙的信号通路靶向抑癌效果，以罗汉果醇举例来说明甜甙及其类似物的靶向抑癌效果。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：罗汉果甜甙的制备方法，包括以下步骤：1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得到不同糖基化程度的白色结晶罗汉果甜甙。甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。本专利技术提供了罗汉果甜甙单体的制备方法，该制备方法通过预处理、特定树脂的分离、浓缩、特定树脂的分离、浓缩、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度在98％以上。罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃，反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥，得到罗汉果醇。本专利技术提供的罗汉果醇的制备方法，该制备方法通过预处理、特定树脂的分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度在96％以上。甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。罗汉果甜甙上的糖基水解后，可得到罗汉果醇，罗汉果醇是甜甙生物合成的前体，甜甙是罗汉果醇糖基化的衍生物。罗汉果醇骨架上C3和C24位置上连接的葡萄糖基数目不同，形成不同种类甜甙化合。罗汉果甜甙ⅠE1为罗汉果醇C3位加入1个糖基后的衍生物；罗汉果甜甙ⅡA2为罗汉果醇C3位，加入2个糖基后的衍生物；罗汉果醇上加入三个或多个糖基后会依次生成甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等。本专利技术还本文档来自技高网...

【技术保护点】
罗汉果甜甙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6‑8的比例加入水，在80～95℃条件下提取2‑4次，每次1～2小时，合并提取液；2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；3)将所述水溶液采用XAD‑16树脂进行吸附，用30～50％乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水‑乙醇混合溶液；4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中加入4‑5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；5)将粗品甜甙的水溶液采用Diaion PA树脂进行脱色处理，收集下柱液，得到富集液；6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈‑水，按照20％‑75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得到不同糖基化程度的白色结晶罗汉果甜甙。

【技术特征摘要】
1.罗汉果甜甙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，
在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性
蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇
进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中
加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收
集下柱液，得到富集液；
6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得
到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照
20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得到不同糖
基化程度的白色结晶罗汉果甜甙。
2.罗汉果醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水，
在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；
2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性
蛋白，得到澄清的水溶液；
3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇
进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；
4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向
浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水
溶液；
5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收
集下柱液，得到富集液；
6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃，
反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；
7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品
水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘灿，窦德泉，马兰青，孙媛霞，荣龙，赵晓萌，李钧涛，王燕，毕正子，毕肖竹，胡海文，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11