双参数细胞周期分析方法技术

本发明专利技术公开了一种双参数细胞周期分析方法，主要解决现有分析方法中不能将细胞周期区分得更为详细的不足。该方法将鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白Ａ单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按１～１６∶１～１６∶８００的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ和Ａ单克隆抗体的混合抗体，利用此混合抗体以及碘化丙啶和核糖核酸酶混合液对所要分析的各种细胞包括肿瘤细胞和正常细胞进行染色，并通过流式细胞仪对其进行荧光检测，从而获得细胞周期蛋白Ｅ＋Ａ表达情况的二维等高图，在图中人们可以清晰地将细胞周期区分为Ｇ＃－［０］期、早Ｇ＃－［１］期、晚Ｇ＃－［１］期、Ｓ期、Ｇ＃－［２］期和Ｍ期六个细胞群体。该方法能减少检测误差，节约样本细胞量，并对肿瘤的研究分析和治疗有很强的指导意义。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基础医学领域中对细胞的分析研究，具体地指一种。
技术介绍
基础医学领域中对细胞的分析研究最初是从一百多年前开始的。1879年Flemming W.通过光学显微镜对活细胞进行观察，可将细胞周期分为有丝分裂间期和有丝分裂期，此即为细胞周期分析方法的萌芽，其简单、粗略可想而知。随着人们对细胞的不断深入研究和检测技术手段的不断发展和更新，1969年Vandilla MA.采用流式细胞术对细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)进行分析，通过流式细胞仪所检测得到的脱氧核糖核酸含量直方图(DNA content histogram)可将细胞周期分为G0/G1期、S期、G2/M期三个细胞群体。但其对S期的分析需用数学公式进行推断，而且与G0/G1期以及G2/M期的期峰值有部分重叠，为了对S期进行更为详细的分析，众多的学者都在不停地探索更优的方法。到了90年代，随着细胞周期调控机制的突破，人们发现细胞周期蛋白(Cyclin)是一种位于细胞内且与细胞周期相关的蛋白质。细胞周期蛋白包括A～I种类型，细胞周期蛋白A～I可分别写为Cyclin A、Cyclin E、……Cyclin I。通过流式细胞仪对细胞周期蛋白E与脱氧核糖核酸(DNA)同时进行检测的方法称为Cyclin E/DNA双参数流式细胞术，该方法能将细胞周期分为G0期、早G1期、晚G1期、S期、G2/M期五个细胞群体；通过流式细胞仪对细胞周期蛋白A与脱氧核糖核酸(DNA)同时进行检测的方法称为Cyclin A/DNA双参数流式细胞术，该方法能将细胞周期分为G0/G1期、S期、G2期、M期四个细胞群体。上述方法揭示了细胞周期蛋白在细胞周期中的表达规律，从而使应用细胞周期蛋白进行细胞周期分析成为可能。但为了对细胞周期进行更为详细的分析，人们不得不逐一地对单个种类的细胞周期蛋白进行分析，这就无法避免多次实验之间带来的误差，进而导致细胞周期分析的不正确性概率加大。因此，在临床和实验室的细胞样本分析中，采用上述单个种类的细胞周期蛋白逐一检测的方法，很难满足医学上只取少量的细胞样本并能将其区分得更为详细的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要克服上述分析方法不足，提供一种可以同时对同一样本的细胞进行细胞周期分析、且能将细胞周期区分得更细、检测误差率更低、所需样本细胞量更少的。为实现此目的，本专利技术所探索和研究出的，包括以下步骤1)取经70～80％冰乙醇固定至少2小时以上的浓度为2～8×105个/毫升的细胞2～4毫升，离心去除固定液，用磷酸盐缓冲液清洗一遍；2)在步骤1)所得的细胞中加入0.5～1毫升的表面活性剂，放置5～10分钟；3)用2～4毫升磷酸盐缓冲液将步骤2)所得的细胞清洗一遍，再吸干残液；4)配制鼠抗人细胞周期蛋白单克隆混合抗体将鼠抗人细胞周期蛋白E单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白A单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按1～16∶1～16∶800的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白E和A单克隆抗体的混合抗体，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为0.01克/毫升；5)将步骤3)所得的细胞与0.05～0.2毫升步骤4)所配制的混合抗体充分混合均匀，并在温度为2～8℃的条件下放置30分钟～48小时；6)用2～4毫升磷酸盐缓冲液将步骤5)中经混合抗体孵育后的细胞清洗一遍，再吸干残液；7)配制异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液将异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白和小牛血清白蛋白液按1∶10～20的体积比混合，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为0.01克/毫升；8)将步骤6)中经清洗过的细胞与0.05～0.2毫升步骤7)所配制的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液充分混合均匀，并在室温条件下避光放置20～30分钟；9)用磷酸盐缓冲液将步骤8)中经荧光素标记的细胞再清洗一遍；10)配制碘化丙啶和核糖核酸酶混合液将碘化丙啶与核糖核酸酶同置于磷酸盐缓冲液中稀释，使碘化丙啶的浓度为0.005～0.1毫克/毫升，核糖核酸酶的浓度为0～0.01毫克/毫升；11)将步骤9)中经清洗过的细胞与0.5～1毫升步骤10)所配制的碘化丙啶和核糖核酸酶混合液相混合，室温避光放置20～30分钟，用流式细胞仪对其进行检测，即可将细胞周期分为G0期、早G1期、晚G1期、S期、G2期和M期六个细胞群体。上述步骤1)中的细胞可经80％冰乙醇固定12～24小时。对细胞内蛋白质固定需要一定的时间，且应选用对细胞膜没有交联作用的固定剂，实验表明80％冰乙醇对细胞膜没有交联作用，用其固定细胞12～24小时效果较好。上述步骤2)中加入的表面活性剂最好用0.25％Triton X-100，即TritonX-100与磷酸盐缓冲液的体积比为0.25％，放置的时间为5分钟。TritonX-100是一种现有的非离子表面活性剂，它不仅不会破坏细胞膜成分，而且能很好地增加细胞膜的通透性。上述步骤4)中将鼠抗人细胞周期蛋白E单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白A单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按8～16∶1～8∶800的体积比混合较佳，而按16∶4∶800的体积比混合最佳。上述两种抗体是直接与抗原即细胞周期蛋白结合的，既要使其结合有特异性，又要使其结合充分，故上述浓度最为经济实用。如果浓度过高的话，一些非特异性物质就会结合进来，影响检测效果，而浓度过低的话，则结合就不充分，同样影响检测效果。上述步骤5)中可取0.1毫升混合抗体与细胞充分混合均匀，并在温度为4℃的条件下放置12～14小时。抗体为蛋白质，要使其与抗原充分结合需要一定时间，且不能让其变质，故宜将其置于4℃的条件下放置12～14小时为佳。上述步骤7)中将异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白和小牛血清白蛋白液按1∶20的体积比混合较好。荧光素标记的免疫球蛋白与抗体结合应充分结合，这样才能将结合了细胞周期蛋白的混合抗体明显标示出来，故其浓度选择高一些为佳，但过高则会浪费试剂。本专利技术的通过流式细胞仪对细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A以及脱氧核糖核酸(DNA)同时进行检测，又称为Cyclin E+A/DNA双参数流式细胞术。其优点在于该方法能同时对同一样本细胞进行细胞周期分析，可将样本细胞周期分为六个细胞群体G0期、早G1期、晚G1期、S期、G2期和M期，同时避免了逐一采用CyclinE/DNA双参数流式细胞术和Cyclin A/DNA双参数流式细胞术进行细胞分析而带来的检测误差和不正确性，并可极大地节约样本细胞量，这在细胞组织越来越难以获得的今天，有其独到和难以替代的优越性。而在临床医学实践中，越来越多的资料显示肿瘤是一类细胞周期疾病，表现在细胞周期驱动机制的失控以及监控机制的破坏上，有关细胞周期的深层次分析不但可以对肿瘤机制产生更深层次的认识，还可以对肿瘤的治疗提供重要资料。现在一般认为肿瘤的发生主要是因为细胞周期中特异期相性的检测点遭破坏而造成的，因此对细胞周期分期更为详细可以对肿瘤进行更加深入的研究，并可以对某一细胞群体也进行更加深入的研究。同时，现在的肿瘤治疗以选用细胞周期特异性药物为主，因而本专利技术方法的建立可以避免肿瘤用药的盲目性，并对用药剂量也有很强的指导意义。附图说明图1为采用普通流式细胞术所测得的细胞周期蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双参数细胞周期分析方法，包括以下步骤：１）取经７０～８０％冰乙醇固定至少２小时以上的浓度为２～８×１０↑［５］个／毫升的细胞２～４毫升，离心去除固定液，用磷酸盐缓冲液清洗一遍；２）在步骤１）所得的细胞中加入０．５～１毫升的表面活 性剂，并放置５～１０分钟；３）用２～４毫升磷酸盐缓冲液将步骤２）所得的细胞清洗一遍，再吸干残液；４）配制鼠抗人细胞周期蛋白单克隆混合抗体：将鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白Ａ单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按１～１６∶ １～１６∶８００的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白Ｅ和Ａ单克隆抗体的混合抗体，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为０．０１克／毫升；５）将步骤３）所得的细胞与０．０５～０．２毫升步骤４）所配制的混合抗体充分 混合均匀，并在温度为２～８℃的条件下放置３０分钟～４８小时；６）用２～４毫升磷酸盐缓冲液将步骤５）中经混合抗体孵育后的细胞清洗一遍，再吸干残液；７）配制异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液：将异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白和 小牛血清白蛋白液按１∶１０～２０的体积比混合，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为０．０１克／毫升；８）将步骤６）中经清洗过的细胞与０．０５～０．２毫升步骤７）所配制的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液充 分混合均匀，并在室温条件下避光放置２０～３０分钟；９）用磷酸盐缓冲液将步骤８）中经荧光素标记的细胞再清洗一遍；１０）配制碘化丙啶和核糖核酸酶混合液：将碘化丙啶与核糖核酸酶同置于磷酸盐缓冲液中稀释，使碘化丙啶的浓度为０．００５～０．１ 毫克／毫升，核糖核酸酶的浓度为０～０．０１毫克／毫升；１１）将步骤９）中经清洗过的细胞与０．５～１毫升步骤１０）所配制的碘化丙啶和核糖核酸酶混合液相混合，室温避光放置２０～３０分钟，用流式细胞仪对其进行检测即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建平，覃吉超，陶德定，冷彦，申漫里，冯永东，高纯，余源，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]