玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1及其编码基因制造技术

本发明专利技术提供了一种玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2的同源基因ZmPHO2;H1,在耐低磷自交系178中克隆所得序列，其核苷酸序列如SEQID No.2所示，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。本发明专利技术设置了正常磷浓度（1mmol/L）、四个低磷水平（无磷、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）处理12h和八天并做定量分析，结果表明在某些特定的时间段，不同低磷浓度处理下该基因的表达量低于正常磷水平，并且证实了该基因在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中不同的表达规律，为了该基因后续在研究中的应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1及其编码基因
本专利技术属于基因工程和分子生物学
，尤其涉及一种玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1实验设计创新及其应用。
技术介绍
磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小分子，如能源供应者ATP的重要组成成分，是各种糖代谢，如糖降解必须的中介物，是生物发育的调节物，如磷酸化等。因此，施加磷肥对提高作物产量起着关键作用。玉米是一种重要的粮食作物和经济作物，土壤低磷严重影响玉米的正常生长发育。张继海等通过对多份玉米自交系进行耐低磷力鉴定，筛选出一批耐低磷的种质，耐低磷玉米自交系178就属于其中一个表现优异的种质。耐低磷玉米能够在低磷条件下提高对磷的利用率，提高玉米的产量，其中磷转运蛋白上游调控基因在耐低磷的作用机制中起到关键作用。因此，阐明该基因在低磷处理时的表达模式和在不同低磷浓度处理下的表达特征，并在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中测得可溶性磷含量，有利于阐明耐低磷机制，为提高玉米耐低磷能力和玉米产量提供重要的研究方向。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1及其应用，本专利技术提供的玉米基因ZmPHO2;H1在低磷环境下受到抑制，使磷酸盐从地上部分向地下部分运输受到一定程度的抑制，从而保持叶片中磷浓度处于正常状态，不会受到缺磷的影响。并发现了在ZmPHO2;H1蛋白结构域中络氨酸变为半胱氨酸，而半胱氨酸在泛素结合酶复合体形成中起到非常关键的活化作用，对后续抑制或降解磷转运蛋白起到重要的调控作用，因此，深入研究该基因在这个位点上的突变带来的功能变化有重要意义。本专利技术提供了一种玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供编码上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供含有编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1的载体及含有该载体的宿主细胞。本专利技术设置了正常磷浓度（1mmol/L）、四个低磷水平（无磷、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）处理12h和八天并做定量分析，结果表明在某些特定的时间段，不同低磷浓度处理下的该基因的表达量低于正常磷水平，为了该基因后续在研究中的应用奠定基础。本专利技术还提供了在不同磷浓度不同时间段内处理下，耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中叶和根的有效磷含量，阐明了叶中的有效磷含量要高于根中的有效磷含量，以及在根和叶中有效磷含量的变化规律，进一步证实该基因在研究中的重要价值。本专利技术提供的ZmPHO2;H1基因是从耐低磷自交系178（由四川农业大学玉米研究所提供）中克隆得到的基因，其开发阅读框为1122bp，编码373个氨基酸；其在耐低磷自交系178或者低磷敏感自交系9782的叶和根中均有表达；其与乔草（Setariaitalica）XP_004967378、水稻（Oryzasativa）Os01g0233900、短柄草（Brachypodiumdistachyon）XP_003566089、大麦（Hordeumvulgare）BAK03891、小麦属（Triticumurartu）EMS50616存在高度保守性；其表达的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1包含一个保守结构域UBC（泛素结合酶）；等电点和分子量为：TheoreticalpI/Mw:8.36/41839.39；该ZmPHO2;H1没有跨膜结构域；其表达部位在细胞核内。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1的扩增条带；图2为玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在耐低磷自交系178叶中的相对表达量；图3为玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在耐低磷自交系178根中的相对表达量；图4为本专利技术实施例所提供的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1的氨基酸序列保守结构域的分析结果；图5为本专利技术实施例所提供的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1的跨膜结构域分析结果；图6为本专利技术实施例所提供的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1的表达部位预测分析结果；图7为本专利技术实施例所提供的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1的进化树分析结果；图8为本专利技术实施例所提供的玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1的多重序列比对；图9为编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在低磷敏感自交系9782叶中的相对表达量；图10为编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在低磷敏感自交系9782根中的相对表达量；图11为编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782叶中的相对表达量；图12为编码玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782根中的相对表达量；图13为耐低磷自交系178在12h和8d不同磷浓度的有效磷含量；图14为低磷敏感自交系9782在12h和8d不同磷浓度的有效磷含量。具体实施方式实施例1玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在低磷处理下组织特异性表达1.1玉米磷转运蛋白上游调控基因ZmPHO2;H1在不同组织中表达特征分析1.1.1引物设计本实验选择玉米组成型表达基因18S为内参基因，用于校准不同样品中起始模板量以及RNA反转录效率。依据qRT-PCR引物设计的要求和原则，结合PrimerPremier5.0和Beacondesigner设计目的基因和内参基因的特异性引物，用e-PCR在玉米基因组数据库中对设计的引物进行验证，将只能扩增出单一条带的引物作为候选，送上海Invitrogen公司合成。定量引物信息如下：正向引物F如SEQIDNo.3所示，为：GCTCCTCTGTGAATGTC；反向引物R如SEQIDNo.4所示，为：TTCCTTGCTCTGTCCTT。1.1.2引物的特异性检测以各时段cDNA样品混合液稀释10倍后用作qRT-PCR反应的模板，退火温度梯度范围设定为50～65℃，用于确定最佳Tm值，同时根据溶解曲线的峰型检测引物的特异性。10μL反应体系见表1，qRT-PCR反应在CFX96Manager（Bio-RadUSA）进行，反应程序见表2。表1荧光定量PCR的反应体系Eva-GreenSuperMix5上游引物（4.0μmol/L）0.5下游引物（4.0μmol/L）0.5稀释的cDNA1ddH2Oupto10表2荧光定量PCR的扩增程序1.1.3标准品的制备及标准曲线的优化根据溶解曲线挑选特异性扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并回收目的条带。通过T/A法将回收得到的目的产物与19-TSimpleVector(TaKaRa，中国大连)连接，热击法转化大肠杆菌（E.coli）DH5α扩大培养后提取质粒，并依次稀释成以下七个浓度梯度（copies/μL）：1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103，制备成定量标准品来制作目的基因和内参基因的标准曲线。1.1.4实时荧光定量PCR（qRT-PCR）将反转录得到的样品cDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.玉米磷转运蛋白上游调控因子ZmPHO2;H1，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.编码权利要求1所述蛋白的基因。3.如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高世斌，刘丹，吴玲，田跃飞，苏顺宗，荣廷昭，潘光堂，刘坚，张志明，林海建，沈亚欧，聂治，张啸，刘文军，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51