ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法技术

本发明专利技术公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，ω-转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。本发明专利技术还公开了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。本发明专利技术利用温度因子(B-factor)结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，制得所述ω-转氨酶突变体。本发明专利技术筛选得到的突变体热稳定性优于野生型转氨酶。

【技术实现步骤摘要】
ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法。
技术介绍
酶的稳定进化方法一直是蛋白质工程中极为重要的研究领域之一。近年来，计算机辅助的蛋白质稳定化设计取得突破式的进展。与传统随机突变进化方法相比，以能量计算为基础的计算辅助设计方法可以提高氨基酸突变的有效性，减少突变数目，降低筛选工作量，极大地提高设计成功率。对酶分子的热稳定性改造而言，目前已有多种设计方法应用于识别酶的不稳定区域，并已在一些酶的热稳定性改造中得到了成功应用。温度因子(B-factor)是晶体学中的一个重要参数，反映的是晶体中的各原子受热运动的影响程度，原子在热运动作用下的形变越大，温度因子值就越高。对蛋白质而言，如果某一氨基酸残基的B-factor值越高，则表明该氨基酸残基所在部位的结构就越不稳定。因此可以分析蛋白质结构中各个氨基酸残基的B-factor值，从而识别出需要改造的、不利于保持蛋白质稳定性的区域。定点突变(site-directedmutagenesis或site-specificmutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对的技术，通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构和功能的影响。在酶的理性设计中，研究者采用定点突变技术筛选得到热稳定、酶活力提高的突变酶。公告号为CN102660515B的专利文献公开了一种酶活性提高的谷氨酰胺转氨酶。该专利技术以谷氨酰胺转胺酶在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。转氨酶能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，具有较高区域选择性和立体选择性。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-ATs)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。来自于土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶能催化(R)-α-甲基苄胺生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。实验表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其耐热性有待进一步提高。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供了ω-转氨酶突变体，通过定点突变替换掉热稳定性差的氨基酸残基，获得比野生型转氨酶具有更好热稳定性的ω-转氨酶突变体，提高ω-转氨酶在工业上的应用价值。ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示。第一种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为苯丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(T130F)的半失活温度为40.9℃，比野生型酶提高2.9℃；ω-转氨酶突变体(T130F)在40℃下的半衰期为13.2min，比野生型酶延长6.3min。第二种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为甲硫氨酸，ω-转氨酶突变体(T130M)的半失活温度为40.7℃，比野生型酶提高2.7℃；ω-转氨酶突变体(T130M)在40℃下的半衰期为10.8min，比野生型酶延长3.9min。第三种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸，ω-转氨酶突变体(T130A)的半失活温度为39.1℃，比野生型酶提高1.1℃；ω-转氨酶突变体(E133F)在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型酶延长3.5min。第四种ω-转氨酶突变体的第133位氨基酸由谷氨酸突变为苯丙氨酸，ω-转氨酶突变体(E133F)的半失活温度为39.6℃，比野生型酶提高1.6℃；ω-转氨酶突变体(E133F)在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型酶延长3.5min。第五种ω-转氨酶突变体的第133位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺，ω-转氨酶突变体(E133Q)的半失活温度为39.2℃，比野生型酶提高1.2℃；ω-转氨酶突变体(E133Q)在40℃下的半衰期为9.2min，比野生型酶延长2.3min。本专利技术还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。本专利技术提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因，其核苷酸分别为如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示。五个突变体的核苷酸序列的变化情况依次为：将编码野生型酶第130位氨基酸的密码子ACT分别突变为TTT、ATG和GCG，第133位氨基酸的密码子GAA分别突变为TTT和ATG。本专利技术还提供了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。所述表达盒的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，ω-转氨酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a(+)。所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。本专利技术还提供了一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)获得野生型酶中各个氨基酸残基的B-factor值，确定需要突变的氨基酸残基；(2)计算酶突变前后的折叠自由能之差，预测可行的突变；(3)根据预测结果，设计定点突变引物，以野生型酶为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的酶突变体。该方法可有效增加突变成功的概率，降低筛选工作量，提高实验效率。采用该方法获得的突变体比野生转氨酶具有更好的热稳定性，从而证明了本专利技术突变位点预测筛选方案的可行性。作为优选，计算折叠自由能的程序为FoldX(http://foldxsuite.crg.eu/)。作为优选，所述野生型酶为来自土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶。本专利技术分析土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶的晶体结构数据，G129、T130、R131、E133、D134的B-factor值较高，表明这些氨基酸残基的存在不利于保持蛋白质稳定性。折叠自由能(ΔGf)是蛋白质热力学中最重要的参数之一，采用FoldX软件计算突变酶与野生型转氨酶之间的折叠自由能之差(ΔΔGf)，ΔΔGf为负时，说明该突变体较野生型稳定，为可行的突变。根据软件计算结果确定18种突变方案，分别为T130F、T130M、T130A、T130L、T130V、T130I、T130C、T130K、T130R、R131P、R131F、E133L、E133K、E133Q、E133W、E133Y、E133F、D134L。对ΔΔGf为负的18个突变体设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板进行PCR扩增，转化至宿主细胞，进行突变酶的表达、纯化；通过测定半失活温度(T5010)和半衰期(t1/2本文档来自技高网...

【技术保护点】
ω‑转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。

【技术特征摘要】
1.ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示。2.编码权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示。4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达盒。5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。6.一种包含权利要求4所述表达盒的重组质粒。7.一种包含权利要求6所述重组质粒的转化子。8.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌细胞。9.一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)获得野生型酶中各个氨基酸残基的B-factor值，确定需要突变的氨基酸残基；(2)计算酶突变前后的折叠自由能之差，预测可行的突变；(3)根据预测结果，设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的酶突变体；所述野生型酶为分离自土曲霉(Aspergillust...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，谢东芳，楼坚，蒋成君，吴元锋，龚金炎，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33