一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目标DNA序列互补的肽核酸捕获探针以及电化学活性标记物，该方法将一段与目标DNA序列互补的肽核酸固定在金电极表面作为捕获探针，与目标DNA序列杂交后，以与目标DNA序列定量结合的氨基二茂铁作为电化学活性标记物，实现对目标DNA序列的快速、高灵敏度、高选择性检测。该传感器结构简单、制备工艺简便、检测时间短、成本低廉、灵敏度高、选择性好、重现性好、抗干扰能力强，可用于医学诊断、环境监测以及法医鉴证等领域中核酸样品的快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法，应用于核酸检测领域。
技术介绍
随着人们生活水平的逐步提高和全球化程度的进一步加深，亟需一种灵敏度高、选择性好的检测手段，以满足医学诊断、环境监测以及法医鉴证等领域中核酸样品的实时快速检测的需求。与传统的光学检测方法相比，电化学方法用于核酸分析时具有灵敏度高、选择性好、成本低廉、检测时间短、装置简单、便携性好，以及易于小型化等优良特性，因而在近年来在国民经济的诸多部门，如食品、制药、化工、临床检测、生物医学、环境监测等领域，获得了相当广泛的应用。肽核酸是一种人工合成的核酸类似物，DNA分子中的电负性的脱氧核糖磷酸骨架被呈电中性的N-(2-氨乙基)-甘氨酸骨架取代而成。肽核酸能与互补的核酸链以碱基互补配对的方式结合形成稳定的双螺旋，并且能以螺旋入侵的方式与双螺旋DNA的大沟稳定结合。与常规DNA探针相比，肽核酸探针具有杂交效率高、热稳定性好、选择性好以及抗酶解能力强等优良特性。因此，其可被用于疾病的基因诊断、点突变、基因序列和结构分析等领域中。在相关的文献报导中，为了将电化学活性物质(如二茂铁)引入到DNA生物传感分析体系，常用的方法包括：1)将电化学活性物质直接修饰在捕获探针末端(10.1016/j.bios.2014.03.009)；2)将电化学活性物质修饰在目标DNA序列上(10.1016/j.bios.2010.03.017)；3)使用一段修饰有电化学活性物质的信号探针(10.1016/j.jelechem.2013.12.018)。尽管这些方法都很有效，并且都得到了相当广泛的应用，但是这些体系都很复杂，制备、分离和纯化过程相当费时和繁琐，因而实用性都比较差，无法满足医学诊断、环境监测以及法医鉴证等领域的需求。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法。本专利技术所述传感器结构简单、制备工艺简便、检测时间短、成本低廉、灵敏度高、选择性好、重现性好、抗干扰能力强，可用于医学诊断、环境监测以及法医鉴证等领域中核酸样品的快速检测。实现本专利技术的技术解决方案为：一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法，包括以下步骤：步骤一、将含目标DNA序列的溶液滴加到肽核酸探针修饰的金电极表面，杂交反应结束后，将电极表面清洗干净；步骤二、将步骤一所得电极表面浸泡在含电化学活性标记物的标记溶液中，反应一段时间后，即得电化学DNA生物传感器。步骤一中，肽核酸探针修饰的金电极是将洁净的金电极浸泡在含巯基化肽核酸探针的溶液中进行修饰，再用巯基己醇对电极表面残留的活性位点进行封闭后得到。进一步的，含巯基化肽核酸探针的溶液中巯基化肽核酸探针的浓度为0.01～10μM，修饰温度为20-50℃，探针修饰时间为0.25～24h，巯基己醇浓度为0.1～10mM。步骤一中，杂交反应温度为20～50℃，杂交反应时间为0.25～5h。步骤二中，电化学活性标记物为氨基二茂铁，标记溶液中还包括碳二亚胺和咪唑，其中，氨基二茂铁浓度为0.05～20mg/mL，碳二亚胺浓度为0.1～50mg/mL，咪唑浓度为0.01～10M，进一步的，碳二亚胺为二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中任意一种。步骤二中，标记溶液的溶剂为酒精溶液。步骤二中，反应时间为0.25～5h，反应温度为15～50℃。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：①本专利技术通过采用具有高选择性和高杂交效率的肽核酸作为捕获探针，提高了核酸电化学生物分析的选择性，并且可以实现金电极的重复利用，有利于降低检测成本；②电化学活性标记物在碳二亚胺和咪唑的作用下被一步偶联到了电极表面，操作简便，检测时间短，成本低廉；③本专利技术的电化学DNA生物传感器，体系简单，实用性强。附图说明图1是本专利技术中将氨基二茂铁偶联到单链DNA末端的原理图。图2是本专利技术一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备过程示意图。图3是本专利技术电化学DNA生物传感器对不同浓度的DNA的差分脉冲伏安响应曲线(A)及其响应峰电流的校准曲线(B)。图4是本专利技术电化学DNA生物传感器对不同DNA序列的电化学响应。图5是本专利技术电化学DNA生物传感器在血清样品中的电化学响应。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，以便于更好地理解本专利技术，因而不应视为限定本专利技术的范围。图1示出了本专利技术一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备过程中将氨基二茂铁偶联到单链DNA末端的原理图，该原理具体如下：首先，碳二亚胺将DNA末端的磷酸基团活化，生成一种瞬态的、高活性的磷酸二酯中间体；接着，该中间体与咪唑反应，生成一种稳定的、高活性的磷酸咪唑复合物；随后，氨基二茂铁中的氨基部分对复合物中的咪唑部分进行亲核取代，将氨基二茂铁偶联到DNA末端。该偶联反应，反应条件温和、操作简便，偶联速率快，因而具有很好的实用价值。实施例1：如附图2中所示步骤，制备本专利技术电化学DNA生物传感器。(1)电极表面的预处理及捕获探针的固定化将金电极表面依次用粒径为0.3和0.05μm的氧化铝悬浮液打磨至镜面，用超纯水和无水乙醇清洗干净后，在水虎鱼酸(98％H2SO4/30％H2O2，3:1，v/v)中浸泡处理10min，用超纯水清洗干净后，在0.5M的稀硫酸中用循环伏安法进行电化学预处理，清洗干净后即得洁净的电极；将已经洁净处理过的金电极在含有1μM的修饰有巯基末端的肽核酸捕获探针(序列：5’-HS-(CH2)11-AACCATACAACCTACTACCTCA-3’)的溶液中在37℃下浸泡1.5h，再用2mM巯基己醇对电极表面残余的位点进行封闭，即得到肽核酸探针修饰的金电极。(2)DNA杂交将含目标DNA片段(序列：5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3’)的溶液滴加到修饰后所得的电极表面，37℃下反应1.5h，反应完成后，将电极表面清洗干净。(3)标记电化学活性物质将含氨基二茂铁、碳二亚胺(浓度为10mg/mL)和咪唑(浓度为0.1M)的混合溶液滴加在电极表面，室温下反应1.5h，即得电化学DNA生物传感器。(4)电化学检测用差分脉冲伏安法对连接在电极表面的氨基二茂铁进行检测。实施例2：本专利技术电化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将含目标DNA序列的溶液滴加到肽核酸探针修饰的金电极表面，杂交反应结束后，将电极表面清洗干净；步骤二、将步骤一所得电极表面浸泡在含电化学活性标记物的标记溶液中，反应一段时间后，即得电化学DNA生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将含目标DNA序列的溶液滴加到肽核酸探针修饰的金电极表面，杂交反应结束后，将电极表面清洗干净；
步骤二、将步骤一所得电极表面浸泡在含电化学活性标记物的标记溶液中，反应一段时间后，即得电化学DNA生物传感器。
2.如权利要求1所述的基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤一中，肽核酸探针修饰的金电极是将洁净的金电极浸泡在含巯基化肽核酸探针的溶液中进行修饰，再用巯基己醇对电极表面残留的活性位点进行封闭后得到。
3.如权利要求2所述的基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，含巯基化肽核酸探针的溶液中，巯基化肽核酸探针的浓度为0.01～10μM，修饰温度为20-50℃，探针修饰时间为0.25～24h，巯基己醇浓度为0.1～10mM。
4.如权利要求1所述的基于肽核酸的电化学DNA生物传感器的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔金明，胡琼，何玟辉，梅亚琦，张学记，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32