本发明专利技术公开了一种苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用，本发明专利技术中所述α-丁酮酸的制备方法具有催化能力高底物累积可达600g/L以上，转化率达95％以上、反应条件温和、环境友好等优点，在35℃条件下对L-苏氨酸脱氨酶的酶活达到10156.5U/g，L-苏氨酸的转化率达到100％，为α-丁酮酸的大规模生产并为其作为前体的系列关键手性中间体提供了良好的技术支持，具有较高的工业化应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及苏氨酸酶基因、载体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和 应用，属于基因工程领域。 (二） 技术背景苏氨酸脱氨酶（Threoninedeaminase，简称TD，EC4. 3. 1. 19)，又称苏氨酸脱水 酶，是生物体内氨基酸代谢的重要酶类，能够催化L-苏氨酸或L-丝氨酸脱氨生成α- 丁酮 酸或丙酮酸，尤其是在生物催化生产α-丁酮酸的工艺中具有关键的作用。α-丁酮酸是 一种是生产L-2-氨基丁酸、L-异亮氨酸、正丙醇、D-2-羟基丁酸以及食品配料的重要原材 料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇的重要 前体，受到广泛的关注。 目前已经有一些苏氨酸脱氨酶的报道，例如来自于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeriSDM的苏氨酸脱氨酶，其最高的底物浓度为30g/L。然而，这些苏氨酸脱氨酶对高 底物浓度的耐受能力较弱，大大限制了其在工业生产中的应用。因此筛选出新型的表达耐 高底物浓度的苏氨酸脱氨酶基因，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在α- 丁 酮酸的制备中具有重要的意义。 (三）
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种新的能够催化L-苏氨酸制备α- 丁酮酸的苏氨酸脱氨 酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更适用于工业化制备该中间体，解决了 一般的苏氨酸脱氨酶最适底物浓度低的问题；应用该菌种生产苏氨酸脱氨酶具有产量高、 工艺简单、便于工业化应用等优点，该菌株可以直接用于α- 丁酮酸的生产，而不需细胞破 碎。 本专利技术采用的技术方案是： 本专利技术提供一种来源于大肠杆菌（Escherichia coli)的苏氨酸脱水酶（记为 EcTD)，所述苏氨酸脱水酶的氨基酸序列为SEQ IDN0:1所示。 1 MADSQPLSGAPEGAEYLRAVLRAPVYEAAQVTPLQKMEKLSSRLDNVILVKREDRQPVHS 61 FKLRGAYAMMAGLTEEQKAHGVITASAGNHAQGVAFSSARLGVKALIVMPTATADIKVDA 121 VRGFGGEVLLHGANFDEAKAKAIELSQQQGFTWVPPFDHPMVIAGQGTLALELLQQDAHL 181 DRVFVPVGGGGLAAGVAVLIKQLMPQIKVIAVEAEDSACLKAALDAGHPVDLPRVGLFAE 241 GVAVKRI⑶ETFRLCQEYLDDIITVDSDAICAAMKDLFEDVRAVAEPSGALALAGMKKYI 301 ALHNIRGERLAHILSGANVNFHGLRYVSERCELGEQREALLAVTIPEEKGSFLKFCQLLG 361 GRSVTEFNYRFADAKNACIFVGVRLSRGLEERKEILQMLNDGGYSVVDLSDDEMAKLHVR 421 YMVGGRPSHPLQERLYSFEFPESPGALLRFLNTLGTYWNISLFHYRSHGTDYGRVLAAFE 481 LGDHEPDFETRLNELGYDCHDETNNPAFRFFLAG* 任何对SEQIDNO:1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得 的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属 于本专利技术的保护范围。 进一步，为实现EcTD在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程 常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDN0 :1氨基酸序列的该苏氨酸脱氨酶 的核苷酸序列，如SEQIDN0:2所示。 1 ATGGCGGACTCTCAGCCGCTGTCTGGCGCACCGGAAGGTGCTGAATACCTGCGTGCTGTA 61 CTGCGTGCTCCGGTGTACGAAGCCGCCCAGGTGACGCCGCTGCAGAAGATGGAAAAACTG 121 TCTTCCCGTCTGGATAATGTGATTCTGGTGAAACGTGAGGATCGTCAGCCGGTACACAGC 181 TTCAAACTGCGTGGTGCCTACGCAATGATGGCTGGTCTGACCGAAGAACAGAAAGCACAC 241 GGCGTTATTACGGCATCTGCTGGTAACCACGCACAGGGCGTAGCGTTCTCTTCCGCGCGT 301 CTGGGCGTGAAAGCGCTGATCGTTATGCCAACCGCAACCGCCGACATCAAAGTAGATGCT 361 GTGCGTGGCTTTGGCGGTGAAGTACTGCTGCATGGTGCAAACTTTGATGAGGCTAAAGCG 421 AAGGCGATCGAACTGTCTCAGCAACAGGGCTTCACTTGGGTTCCTCCGTTCGATCACCCG 481 ATGGTTATTGCCGGTCAGGGCACCCTGGCCCTGGAACTGCTGCAGCAAGATGCCCATCTG 541 GACCGTGTCTTTGTACCGGTCGGCGGCGGTGGTCTGGCTGCAGGTGTAGCGGTTCTGATC 601 AAACAGCTGATGCCGCAGATTAAAGTCATTGCGGTTGAAGCTGAAGATAGCGCGTGCCTG 661 AAAGCAGCACTGGATGCGGGCCATCCGGTTGATCTGCCGCGTGTTGGTCTGTTTGCCGAA 721 GGCGTTGCAGTTAAACGCATTGGTGATGAAACTTTTCGTCTGTGCCAGGAATACCTGGAC 781 GACATCATCACTGTCGACTCCGATGCGATTTGTGCTGCTATGAAAGATCTGTTCGAAGAC 841 GTGCGCGCTGTAGCTGAACCGTCTGGTGCTCTGGCTCTGGCAGGCATGAAGAAATATATC 901 GCTCTGCATAACATCCGCGGTGAACGTCTGGCCCATATCCTGTCTGGCGCTAACGTGAAC 961 TTCCACGGCCTGCGTTACGTGTCCGAACGTTGCGAACTGGGCGAACAGCGTGAAGCCCTG 1021 CTGGCAGTTACTATCCCGGAGGAAAAGGGTTCCTTCCTGAAATTCTGCCAGCTGCTGGGT 1081 GGCCGTAGCGTTACGGAATTCAATTACCGCTTCGCGGACGCTAAAAACGCGTGCATCTTC 1141 GTGGGCGTACGTCTGTCTCGCGGTCTGGAGGAACGTAAGGAGATCCTGCAGATGCTGAAC 1201 GATGGTGGCTATTCTGTAGTTGATCTGTCTGACGATGAAATGGCTAAACTGCACGTGCGT 1261 TATATGGTCGGCGGTCGTCCATCCCATCCGCTGCAGGAACGTCTGTATTCCTTTGAATTC 1321 CCTGAGTCTCCGGGTGCACTGCTGCGTTTCCTGAATACCCTGGGCACCTATTGGAACATC 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苏氨酸脱水酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，徐建妙，柳志强，胡海峰，傅芳田，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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