新型葡萄糖酸脱水酶制造技术

本发明专利技术提供一种具有生产上实用的热稳定性及保存稳定性，可以由醛糖酸高效生成相应的２－酮－３－脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶、和决定该葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因、以及用含有该葡萄糖酸脱水酶或该基因的转换细胞制造２－酮－３脱氧醛糖酸以及减少一个碳原子的２－脱氧醛糖酸或２－脱氧醛糖的方法。本发明专利技术提供一种源自木糖氧化无色杆菌（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　　ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０菌株的新型葡萄糖酸脱水酶、以及决定这一葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。提供使该葡萄糖酸脱水酶或含有该基因的转换细胞作用于醛糖酸中，制造相应的２－酮－３－脱氧醛糖酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种能有效地从醛糖酸生成2-酮-3-脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶以及决定该葡萄糖酸脱水酶遗传密码的碱基序列，含有这些碱基序列的质粒以及通过质粒转化后的转换细胞。进一步说，本专利技术涉及一种使用该葡萄糖酸脱水酶或该转换细胞的2-酮-3-脱氧醛糖酸和减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸或2-脱氧醛糖的制造方法。
技术介绍
作为药品原料2-酮-3-脱氧醛糖酸类是有用的化合物。例如，通过脱羧可获得碳原子数减少1个的2-脱氧醛糖酸类或2-脱氧醛糖类。这些作为抗生素、抗病毒药、反义药物(antisense)等的原料等被关注。另一方面，已知催化醛糖酸类脱水生成2-酮-3-脱氧醛糖酸类反应的酶的存在。例如，D-葡萄糖酸脱水合成2-酮-3脱氧-D-葡萄糖酸的酶，作为葡萄糖酸脱水酶(EC4.2.1.39)的起源，已知巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurian)(参照Analytical Biochemistry，(1974)，61，275)产碱菌属(Alcaligenes sp.)M250菌株(参照Methods in Enzymology，(1975)，41，99)，部分硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)(参照Biotechnol.Lett.，(1986)，8，497)等。但是，巴氏芽孢梭菌由来的葡萄糖酸脱水酶被报道了容易受空气氧化，在空气存在下迅速失活的特性。另外，产碱菌属M250菌株由来的萄萄糖酸脱水酶是热稳定性很低的酶，报道了在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的三(羟甲基)氨基甲烷(以下简记为tris)缓冲液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脱水活性下降50％。因此，这些微生物菌种或该微生物菌种由来的酶在培养和反应的操作中反应性下降等，使用困难，很难适用于工业制造。另外，关于部分硫叶菌，它的萄萄糖酸脱水酶没有进行过酶的精制，对它的物理化学性质不十分清楚。使用该微生物菌株的2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸合成中，由于混杂分解生成物2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的活性，存在收率低的问题。如上所述，还没有发现在工业上有实用价值的萄萄糖酸脱水酶，也还没有确立有良好效率的2-酮-3-脱氧醛糖酸类的工业制法。
技术实现思路
本专利技术的课题涉及作为药品原料有使用价值的2-酮-3-脱氧醛糖酸类，提供具有工业实用性的热稳定性和保存稳定性、能有效地生成由醛糖酸相对应的2-酮-3-脱氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脱水酶，以及使用这种酶的2-酮-3-脱氧醛糖酸的制造方法。本专利技术的另一目的是提供在葡萄糖酸脱水酶的生产以及使用葡萄糖酸脱水酶的2-酮-3-脱氧醛糖酸的制造中，决定作为有用材料的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的碱基序列、引入这些碱基序列的质粒以及用该质粒使宿主细胞进行转化得到的转换细胞。针对这个课题进行了尖锐讨论的结果，发现木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株具有高的葡萄糖酸脱水活性。上述现有技术的产碱菌属M250菌株在其文献中有同ATCC9220菌株是同种的记载，相对于产碱菌属M250菌株由来的葡萄糖酸脱水酶正如上述所述的不稳定的报道，本专利技术者们发现将木糖氧化无色杆菌ATCC9220菌体在D-葡萄糖酸中发生作用，反应温度即使在50℃也能保持稳定的活性，能有效地生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。在这里，利用各种精制技术分离由该菌体由来的葡萄糖酸脱水酶，发现该葡萄糖酸脱水酶在55℃保持2小时的情况下，是维持95％或其以上活性的耐热性酶。进一步，相对于上述产碱菌属M250菌株由来的葡萄糖酸脱水酶在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的tris缓冲液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脱水活性下降50％的报道，本专利技术的葡萄糖酸脱水酶在同样条件下，保持1个月稳定的活性，是保存稳定性相当优秀的酶。另外，从上述现有技术的产碱菌属M250菌株精制的葡萄糖酸脱水酶的凝胶过滤层析柱的分子量有270,000±2,500的记载，但本专利技术的葡萄糖酸脱水酶的凝胶过滤层析柱的分子量是188,000±2,500，发现了在分子量上的不同。进一步，成功地决定了如序列表中序列编号1所示的该萄萄糖酸脱水酶的氨基酸序列。进一步，本专利技术者们由于获得了具有如序列表中序列编号1所示的碱基序列的DNA，通过将含有带有这些碱基序列的DNA片断的质粒获得了转换细胞，产生作为活性型的上述萄萄糖酸脱水酶，进一步通过使该转换细胞或该转换细胞处理物在醛糖酸中发生作用，成功高效地制造出相应的2-酮-3-脱氧醛糖酸，从而完成本专利技术。即、本专利技术含有以下各形态。葡萄糖酸脱水酶，其特征在于，具有使D-葡萄糖酸脱水生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸的功能，在含有1mM D-葡萄糖酸钠和1mM氯化镁的30mM tris缓冲液(pH8.5)中，55℃、保持2小时的情况下，保持95％或其以上的活性。所述的葡萄糖酸脱水酶是由木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)由来的。所述的葡萄糖酸脱水酶是用序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列表示。用与序列表的序列编号1中记载的氨基酸序列有70％或其以上相同性的氨基酸序列表示所述的葡萄糖酸脱水酶。决定至中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。决定用序列表的序列编号1中记载的碱基序列表示的至所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。在高严格条件下、与或所述的基因进行杂交的碱基序列表示的、决定至中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码的基因。含有决定至中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶遗传密码基因的质粒。利用所述的质粒使宿主细胞进行转化得到转换细胞。宿主细胞是大肠菌的所述的转换细胞。用至中任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶，或所述的转换细胞，或它们的处理物中的任意一种，在水介质中，转换成与醛糖酸对应的2-酮-3-脱氧醛糖酸的方法。2-脱氧醛糖酸的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，A)在醛糖酸或醛糖酸盐中，使至任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或或所述的转换细胞、或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序。B)工序A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖酸的工序。2-脱氧醛糖的制造方法，其特征在于，由以下的工序组成，A)在醛糖酸类或醛糖酸盐中，使至任意一项所述的葡萄糖酸脱水酶、或或所述的转换细胞或它们的处理物的任意一种在水介质中发生作用，转换成2-酮-3-脱氧醛糖酸的工序。B)工序A)中得到的2-酮-3-脱氧醛糖酸在水介质中使还原剂发生作用，得到2-羟基-3-脱氧醛糖酸的工序，C)在B)工序中得到的2-羟基-3-脱氧醛糖酸在水介质中使氧化剂发生作用，进行脱羧反应，得到减少1个碳原子数的2-脱氧醛糖的工序。至中任意一项所述的任意一项方法，其中，醛糖酸是D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸(D-galactonic acid)、D-岩藻糖酸(D-Fuconicacid)、D-木糖酸(D-Xylonic acid)或L-阿拉伯糖酸(L-arabinonic acid)的任何一种。本专利技术提供一种热稳定性和保存稳定性卓越的新型葡萄糖酸脱水本文档来自技高网...

【技术保护点】
葡萄糖酸脱水酶，其特征在于，具有使Ｄ－葡萄糖酸脱水生成２－酮－３－脱氧－Ｄ－葡萄糖酸的功能，在含有１ｍＭＤ－葡萄糖酸钠和１ｍＭ氯化镁的３０ｍＭｔｒｉｓ缓冲液（ｐＨ８．５）中，于５５℃、保持２小时的情况下，保持９５％或其以上的活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：三宅仁基，八卷俊文，及川利洋，中村武史，石桥大树，福入靖，佐久间笃，小松弘典，安藤知行，富樫和彦，梅谷豪毅，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]