结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒及其使用方法，所述检测试剂盒，包括结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液、结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡组件、测试培养管T、本底对照培养管N、阳性对照培养管P和γ-干扰素质控品，结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液，为共价联接了鼠抗γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒和保存液的混合物。用于定量检测血浆样本中结核T细胞释放γ-干扰素的含量，本发明专利技术将荧光免疫定量分析法通过引入光激发光技术与纳米微球技术，不仅成功的解决了以上试剂盒操作复杂，对技术人员要求高的缺点，并且缩短了检测时间，具有灵敏度、特异性较高的优点。

【技术实现步骤摘要】
结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及结核T细胞释放γ-干扰素的检测试剂盒，具体涉及基于荧光免疫定量分析原理的结核T细胞释放γ-干扰素的检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
结核病是一个全球性的严重公共卫生问题，据世界卫生组织报告，2009年有170万人死于结核病，其中38万人合并HIV感染，死亡率为35％，约有940多万的结核病新增病例，其中110万人合并HIV感染，非洲是全球结核病感染率最高的地区，而亚洲则是结核病患者最多的地区。目前全世界约有33％的人口存在潜伏性结核感染，而且由于多重耐药结核菌株的出现，结核病已对很多国家构成严重的健康威胁,因此如何快速正确的诊断结核病是非常重要的。目前在临床上对结核病的诊断主要依据临床症状，胸部X光片及细菌学检查，这些传统的诊断方法费时且检测率低，延误了早期发现及早期治疗的最佳时机。多年来人们一直希望能找到一种快速的实验室诊断方法。随着对IFN-γ在调节结核感染引起的细胞介导的免疫反应中起到的关键性作用的不断了解，人们逐步认识到γ-干扰素释放试验(interferongammareleaseassays,IGRAs)可用于结核感染的诊断。早期人们发现结核分枝杆菌可以刺激体内T细胞产生免疫反应，所以利用结核分枝杆菌的纯化抗原(Tuberculinpurifiedproteinderivate,PPD)做成结核菌素皮肤试验(Tuberculinskintest,TST)可快速诊断结核病。然而随着人们对诊断方法的深入研究，发现结核菌素试验存在诸多缺点：1)TST中使用的纯蛋白衍生物PPD的某些抗原成分与卡介苗和大多数环境中非结核分枝杆菌的抗原成分相同，易发生交叉反应,使TST出现较高的假阳性率，诊断特异性较低。TST与卡介苗接种及排菌结核患者密切接触程度有关，而不能区别健康人群与感染者。2)TST对免疫抑制的患者特别是合并HIV感染、重症疾病者、年幼儿童及营养不良、器官移植者，缺乏足够的灵敏度。3)TST要求检测人员操作规范，若不慎注入皮下或表皮深部组织，则可降低检测的准确性。4)需要受试者回访，在结果的解释上也存在主观依赖性。5)由于结核病是一种感染性免疫病，在对病人做结核菌素皮肤试验后可能会激发记忆性免疫反应。6)部分受试者近期免疫可能受抑制,导致皮试试验假阴性。1993年Andersen等首先发现早期分泌抗原靶6ku蛋白(earlysecretaryantigenictarget6kuprotein，ESAT-6)和培养滤液蛋白(culturefiltrateprotein，CFP-10)是由RD1区编码,该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中,所有卡介苗菌株及大多数非致病性分枝杆菌基因组中均缺乏该区域。于是利用ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原刺激感染了结核分枝杆菌的机体中具有免疫活性的T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ，并用ELASE检测IFN-γ的浓度来诊断结核感染。因此,用ESAT-6和CFP-10作为结核分枝杆菌感染的特异性T细胞刺激抗原可提高诊断结核感染的特异性。为了增加结核病检测的特异性及灵敏度，近年来随着比较基因组学，分子生物学和免疫学的发展，出现了以T细胞为基础的γ-干扰素释放试验(interferon-gammareleaseassays，IGRAs)。γ-干扰素释放试验是利用结核分枝杆菌特异或非特异抗原在体外刺激受检者全血或外周血单个核细胞(PBMC)，使T淋巴细胞产生大量IFN-γ，然后用酶联免疫吸附法(ELISA)或酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测IFN-γ浓度或计数分泌IFN-γ细胞的方法。目前IGRA已经开始在英、美、日本等国用于活动性结核病和潜伏性结核感染者的诊断，HIV合并结核感染的检测，区别结核感染者与BCG接种以及耐药结核菌感染的快速检测等。但由于澳大利亚的酶联免疫法产品QuantiFERON-TBGOLD(CellestisLtd.,Carnegie,Victoria,Australia)与英国的酶联斑点法产品T-SPOT.TBtest(OxfordImmunotec,Abingdon,UK)存在操作技术要求高，试剂盒价格昂贵等缺点，限制了其在经济发展水平低的发展中国家的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒及其使用方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本专利技术首先涉及一种共价联接了鼠抗γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒，所述的发光微粒，为填充有发光物质的的表面带有官能团的高分子微粒或者二氧化硅微粒，优选的高分子微粒的官能团为羧基、醛基或氨基；高分子微粒的官能团或者二氧化硅微粒与鼠抗γ-干扰素单克隆抗体共价联接，填充不同的发光物质的高分子微粒或者二氧化硅微粒，可在不同波段的光激发下，可发射出不同波段的光，比较常用的高分子化合物如：聚苯乙烯、脲醛树脂等材料，可根据微粒的采购成本及采购难易程度或者配套荧光免疫定量分析仪的激发光源等因素，选择采购合适发射波段的发光微粒；所述的发光物质选自量子点或者荧光染料；所述的荧光染料为镧系稀土元素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白或碘化丙啶；所述的镧系稀土元素铕、铽、铈、镝或钐等；研究发现，由于结核T细胞释放γ-干扰素检测实验中，γ-干扰素释放的量比较低，须在5-400pg/mL的浓度范围将其检出，采用发光物质镧系稀土元素铕的发光微粒作为标记物，具有激发光(365nm)和发射光(610nm)的相互抗干扰性强，本底较低，所以能识别出样本中低浓度的γ-干扰素；研究还发现，由于最终的检测反应是在硝酸纤维膜上进行，发光微粒的粒径(微粒的平均粒径)太大(>400nm),会造成发光微粒在硝酸纤维膜上较难液相流动，影响检测效果，微粒的粒径太小(<100nm),会使制备过程中的清洗工作比较困难，对抗体共价联接工作不利，因此发光微粒的粒径选择最好在100-400nm之间，较好为150-300nm，优选200nm；所述的发光微粒的光发射波段为350-820nm，优选的为532±10nm、620±10nm、525±10nm或680±10nm；发光微粒的表面官能团可以联接任何蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基或醛基或氨基表面官能团的微粒。使用不同表面官能团的微粒，联接抗体的反应方式和反应条件也不相同。可根据微粒的采购成本及采购难易程度或者使用喜好等因素，选择相应表面官能团的微粒，并用合适的反应条件作为鼠抗γ-干扰素单克隆抗体联接的方法；所述的鼠抗γ-干扰素单克隆抗体为公知的物质，可采用商业化产品；本专利技术所述的所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒，包括：(1)结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液、(2)结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡组件、(3)测试培养管(T)、(4)本底对照培养管(N)、(5)阳性对照培养管(P)和(6)γ-干扰素质控品；(1)所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液，为所述的共价联接了鼠抗γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒和保存液的混合物，是独立包装的，可装在试管、塑料管或反应杯中；所述结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液的含量为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
共价联接了鼠抗γ‑干扰素单克隆抗体的发光微粒，其特征在于，所述的发光微粒，为填充有发光物质的、表面带有官能团的的高分子微粒或者二氧化硅微粒，高分子微粒的官能团或者二氧化硅微粒与鼠抗γ‑干扰素单克隆抗体共价联接。

【技术特征摘要】
1.结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液、(2)结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂卡组件、(3)测试培养管T、(4)本底对照培养管N、(5)阳性对照培养管P和(6)γ-干扰素质控品；所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液，为共价联接了鼠抗γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒和保存液的混合物；所述的发光微粒，为填充有发光物质的、表面带有官能团的高分子微粒或者二氧化硅微粒；高分子微粒的官能团或者二氧化硅微粒的官能团与鼠抗γ-干扰素单克隆抗体共价联接；所述高分子微粒选自聚苯乙烯微粒或脲醛树脂微粒；所述的发光物质为镧系稀土元素；所述发光微粒的粒径为100-400nm，所述的发光微粒的光发射波段为350-820nm；所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液的制备方法，包括如下步骤：(1)置换发光微粒溶液：将发光微粒溶液与MES缓冲液混合后，置于温度为2～8℃的冷冻离心机中，以16000～20000转/小时的速度离心5～15分钟后，收集沉淀物发光微粒，发光微粒溶液与MES缓冲液的用量比为：0.3-0.5ml发光微粒溶液/mlMES缓冲液；所述的发光微粒溶液中，发光微粒的含量为：0.1～2g发光微粒/100ml发光微粒溶液；在所述的沉淀物发光微粒中，再加入微量MES缓冲液，再超声分散5～15分钟，获得清洗后的发光微粒悬浮液；MES缓冲液的加入量为：8～12mg发光微粒/mlMES缓冲液；(2)微粒活化：在步骤(1)获得的发光微粒悬浮液中，加入溶解有NHS的MES缓冲液，再加入溶解有EDAC的MES缓冲液，反应20～40分钟；MES缓冲液溶解的NHS中，NHS的含量为3～7mg/ml，MES缓冲液溶解的EDAC中，EDAC的含量为3～7mg/ml；发光微粒悬浮液与溶解有NHS的MES缓冲液的用量比：2～3ml发光微粒悬浮液/ml溶解有NHS的MES缓冲液；发光微粒悬浮液与溶解有EDAC的MES缓冲液的用量比：4～6ml发光微粒悬浮液/ml溶解有EDAC的MES缓冲液；(3)然后将步骤(2)的产物置于温度为2～8℃的冷冻离心机中，以16000～20000转/小时的速度离心5～15分钟后，收集沉淀物，在沉淀物发光微粒中加入MES缓冲液，再超声分散5～15分钟，获得发光微粒悬浮液；沉淀物发光微粒与MES缓冲液的质量体积比为：1～4mg沉淀物发光微粒/mlMES缓冲液；再将发光微粒悬浮液置于温度为2～8℃的冷冻离心机中，以16000～20000转/小时的速度离心5～15分钟后，收集沉淀物发光微粒，在沉淀物发光微粒中加入MES缓冲液，再超声分散5～15分钟，获得活化后的发光微粒悬浮液；沉淀物发光微粒与MES缓冲液的质量体积比为：8～12mg沉淀物发光微粒/mlMES缓冲液；所述MES缓冲液为吗啉乙磺酸的水溶液，用NaOH调pH至5.5-6.7，缓冲液终浓度为0.03～0.07mol/L；(4)抗体共价：将鼠抗γ-干扰素单克隆抗体加入到步骤(3)的活化后的发光微粒悬浮液中，反应1～3小时；鼠抗γ-干扰素单克隆抗体与步骤(3)的产物中的发光微粒的质量比为0.5～2∶10，鼠抗γ-干扰素单克隆抗体浓度为1～5mg/ml；当鼠抗γ-干扰素单克隆抗体浓度大于5mg/ml时，先用MES缓冲液稀释至1～5mg/ml；(5)微粒封闭：在步骤(4)的产物中，加入封闭剂，反应0.5～2小时，反应好后将产物置于温度为2～8℃的冷冻离心机中，16000～20000转/小时的速度，离心5～15分钟，收集沉淀物；所述的封闭剂选自含有150-300mg/ml牛血清白蛋白的纯水溶液；步骤(4)的产物与封闭剂的用量比：2-4ml产物：1ml封闭剂；(6)清洗产物：在步骤(5)沉淀物中加入磷酸盐缓冲溶液，再进行超声分散5～15分钟，使得发光微粒重新均匀悬浮于溶液中，再将发光微粒悬浮液置于温度为2～8℃的冷冻离心机中，16000～20000转/小时的速度，离心5～15分钟，收集沉淀物，为共价联接了鼠抗γ-干扰素单克隆抗体的发光微粒；步骤(5)的沉淀物与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为：1～4mg沉淀物/ml磷酸盐缓冲溶液；(7)稀释分装：将保存液加入步骤(6)中的沉淀物，超声分散5～15分钟，使得发光微粒重新均匀悬浮于溶液中，并稀释，即为所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测微粒悬浮液。2.根据权利要求1所述的结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒，其特征在于，保存液为一种混合物，以0.01mol/LpH7....

【专利技术属性】
技术研发人员：夏晶，陶正杰，
申请(专利权)人：夏晶，
类型：发明
国别省市：广东;44