本发明专利技术公开了一种猴逆转录病毒RT-LAMP的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测的引物组包括一对外引物、一对内引物；检测试剂盒包括引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阴阳性对照和显色液。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，在逆转录酶的作用下对RNA进行反转录，然后采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃对样品模板进行扩增，通过肉眼观察反应管颜色的变化来确定待检样品中是否含有猴逆转录病毒（SRV）RNA。本发明专利技术具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于基层动物疫病监测单位和偏远地区的实验猴养殖企业中进行推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，设及实验动物相关病原的检测方法，具体设 及一种猴逆转录病毒（SRV)的RT-LAMP(ReverseI'ranscriptionandLoop-mediated IsothermalAmplification,反转录环介导等溫扩增反应）检测引物组、检测试剂盒及检测 方法。
技术介绍
猴逆转录病毒（SimiantypeDretrovirus,SRV)，属于逆转录病毒科、肿瘤病毒 亚科的D型病毒。SRV具有逆转录病毒所共有的特性，是单链RNA病毒，内含逆转录酶，病毒 颗粒呈球形，直径80-lOOnm，囊膜上缺乏明显的纤突，感染细胞浆内的病毒为A型颗粒，细 胞外未成熟病毒的核屯、为圆形，成熟病毒的核屯、为圆柱状。病毒W出芽的方式从细胞膜上 释放。SRV可在多种猴的细胞包括猴的B细胞、T细胞、成纤维细胞、唾液腺上皮细胞、膜腺 细胞等中生长。SRV为猴艾滋病的主要病原体之一，.感染后临床上表现为顽固性腹泻、体 重减轻、全身性淋己腺病脾肿大、贫血、中性白细胞减少、淋己细胞减少、坏死性口炎、腹膜 后纤维瘤病等。 到目前为止，发现感染SRV病毒并产生猴艾滋病的非人灵长类动物主要是雜猴属 的动物。近年来，已有SRV感染人的报道。SRV必须通过直接接触才能在猴间进行传播， 主要通过猴间相互撕咬使含于唾液中的病毒进入伤口而传播，而在所有的分泌物和排泄物 中，唾液含病毒量最高。SRV也能通过性传播和经胎盘传播。SRV对不同年龄的猴致病性有 差异，3岁W上的猴抵抗力较未成年猴强，6个月至2岁半的猴最易感，6个月W下的猴有母 源抗体的保护。雄猴和雌猴均易感染，但雌猴的病例较多。 SRV已经被确认为是导致SAIDS的病原体，因此，在猴艾滋病动物模型建立之前一 定要排除运种病原体的干扰。SRV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方 法，常用的实验室诊断方法有PCR法、酶联免疫吸附试验（ELISA)法、间接免疫巧光（IFA) 法、免疫印迹(WB)法、病毒分离法等。PCR法快速、灵敏，但其扩增产物需要进行再一次验 证。病毒分离需要进行细胞培养，周期长、对试验设备要求高，因此，该方法不适合一般的检 。目前，对SRV的检测常用ELISA法和IFA法作为初筛，还必须用WB检测特异性抗体才 能最终确诊。ELISA法和IFA法检测的假阳性率高及WB法操作程序复杂，在一定程度上限 制了其应用范围。因此，不论是为了保障整个猴群的健康还是饲养人员、科研人员的人身安 全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组。 本专利技术的另一个目的在于提供一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒。 本专利技术的另一个目的在于提供猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法。[000引本专利技术所采取的技术方案是： 一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测引物组，其包括一对外引物和一对内 引物，其核巧酸序列分别如下所示： 外引物： 一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其包括上述检测引物 组。 进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中，外引物、内引物的摩尔比 为 1 :8。 进一步的，所述猴逆转录病毒的RT-LAMP检测试剂盒中还含有DNA聚合酶、逆转录 酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照、显色液。 进一步的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述逆转录酶为AMV逆转录酶。[001引进一步的，所述RT-LAMP反应液含有IOmM dNTP、IOX化ermo化1反应缓冲液、 150mM M拆04水溶液。 进一步的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。 进一步的，所述显色液含有750mM巧黄绿素和5mMMnClz的溶液。 一种猴逆转录病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤： O待检样品RNA的提取； 2) 利用权利要求1的引物组对待检样品进行反转录环介导等溫扩增反应； 3) 结果分析：根据反应液颜色变化判定结果，澄色为阴性，绿色为阳性； 进一步的，步骤2)反转录环介导等溫扩增反应的25 反应体系含有：SRV-F3 0. 2yM，SRV-B3 0. 2yM，SRV-FIP1. 6yM，SRV-BIP1. 6yM，RT-LAMP反应液 12. 5"，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.抓，待检RNA1~10化g，显色液2. 5y1，用DEPC水补齐到25y1 ;然 后于63~65°C反应45~60min。 上述检测方法用于非疾病检测或诊断。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果： O高特异性： 本专利技术根据猴逆转录病毒（SRV) (GenBank登录号为M11841. 1)的主要包膜蛋白基因 (ecK)的部分序列设计了 4条特异性引物，应用上述4条引物，扩增祀序列的6个区域，6个 区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引 物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行； 2) 高灵敏度：最低检测极限可达到Ifg/y1含SRV目标片段的质粒DNA; 3) 快速高效：整个扩增只用45~60min即可完成，扩增产量可达IO9~10 1°个拷贝； 4) 操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录等繁琐步 骤，只需要恒溫水浴锅即可反应，条件比较溫和； 5)结果易读：通过肉眼观察反应管内颜色变化即可判读检测结果，无需电泳等其他任 何分析步骤，适合非专业人:t的现场检测。【附图说明】 图1是实施例3特异性的检测结果图（1:SRVRNA;2:SIVRNA;3:HTLVRNA;4 : DEPC水对照）； 图2是实施例4灵敏度的检测结果图（53￥0臟，1:100口邑/^1质粒0臟61?￥);2:10口邑/ 质粒DNA(SRV) ;3:Ipg/质粒DNA(SRV) ;4:IOOfg/质粒DNA(SRV) ;5:IOfg/ 质粒DNA(SRV) ;6:lfg/yl质粒DNA(SRV) ;7:0.1fg/yl质粒DNA(SRV) ;8:DEPC水对照）。【具体实施方式】 W下结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 实施例1猴逆转录病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立 猴逆牵专录病毒的RT-LAMP(ReverseTranscription曰ndLoop-mediatedIsotherm曰I Amplification,反转录环介导等溫扩增反应）检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP 反应液、化迅NA聚合酶、逆转录酶、阳性对照和阴性对照、显色液。 (1)RT-LAMP引物设计：W猴逆转录病毒（SRV)的主要包膜蛋白基因（ecK)为祀基 因，利用软件在线设计SRV特异性R当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测猴逆转录病毒的RT‑LAMP检测引物组，其包括一对外引物和一对内引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物：SRV‑F3：TTTTTGTATGCGGTAATAACAAG（SEQ ID NO:1）；SRV‑B3：AGATACTGCAGTAGTTATACCTAA（SEQ ID NO:2）；内引物：SRV‑FIP：ACCTGGAATAATGTCTATATCGGGT‑GCATACACTTATCTACCCACA（SEQ ID NO:3）；SRV‑BIP：GTGAACCTGTCCCCATTCCA‑TATGACTAGGGGAATAAACTGG（SEQ ID NO:4）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘助红，郭鹏举，张钰，黄韧，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。