本发明专利技术公开了一种微生物来源的双加氧酶粗酶液的制备方法，它的步骤如下：从固体平板上挑取分散泛菌单菌落，接种到种子液培养基上，在pH=6.4，28℃，150r/min的条件下振荡培养10-18h，获得种子液；将种子液按体积比2%的接种量从种子液中接种到发酵培养基中，获得发酵培养液；将发酵培养液在4℃，6000r/min下离心30min，收集发酵液的上清液，得到粗酶液。本发明专利技术采用微生物发酵方法获取双加氧酶粗酶制剂，并利用该粗酶液裂解叶黄素生产香味物质β紫罗兰酮。整个工艺流程不仅简单，而且成本低，催化合成的产物β紫罗兰酮在食品和烟草行业广泛使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种微生物双加氧酶的粗酶制剂的制备方法，并利用该粗酶液降解叶 黄素生产香料物质0紫罗兰酬。
技术介绍
双加氧酶是一类可W使氧分子中的两个氧原子全部与底物结合的加氧酶，通常催 化双键和苯环裂开相关的反应。现有的双加氧酶可来源于植物、细菌或真菌中。然而催化 裂解类胡萝h素的双加氧酶多报道于植物中，却鲜有报道于微生物中。植物中被大量报道 的双加氧酶主要包括五大类：CCD1、CCD4、CCD7和CCD8及NCEDs,运些类型的双加氧酶可W 催化裂解类胡萝h素生产脱辅基类胡萝h素和醒类物质。多数产物属于香味物质，如3-径 基P紫罗兰酬、藏红花醒、香叶基丙酬W及紫罗兰酬等。运些香味物质在食品、烟草行业等 领域具有重要的应用价值。因此开发此类酶制剂可W为工业生产"天然"香味物质提供广 阔的应用前景。 但是，植物培养周期长，双加氧酶表达量不够，无法应有于工业生产。部分文献报 道将植物中的双加氧酶基因克隆到微生物中，并尝试体外表达。但真核生物基因在原核微 生物中表达量不够，难W实现大规模生产。本研究借助微生物发酵直接获得可W裂解叶黄 素的双加氧酶，可W实现大量获取双加氧酶粗酶液，应用于工业生产。同时，获得双加氧酶 粗酶液裂解叶黄素后可生成0紫罗兰酬，是一种重要香味物质。 0紫罗兰酬是一种重要的香料物质和医药前提物，在室溫下有一种特殊香气，可 广泛用于食品及烟草行业。同时0紫罗兰酬还表现出抗微生物、抗致崎变、降血脂等生物 活性。P紫罗兰酬在自然界中可W从部分植物中提取获得，其中包括紫罗兰、龙潑香W及 树替等。运些从植物精油中获得的0紫罗兰酬量微且非常昂贵，目前主要通过化学方法合 成。化学方法的合成步骤非常复杂，并可能产生环境污染和资源浪费，获得的产物难W分 离。因此急需开发可替代化学合成方法的生物合成途径。查阅目前文献，未有相关文献报 道采用微生物酶进行生物催化合成0紫罗兰酬。本专利技术公开的方法在0紫罗兰酬工业生 产上具有重要的应用前景。
技术实现思路
阳〇化]本专利技术的目的利用微生物生长过程来产生双加氧酶，整个过程简单而且快速，可W在短时间内获取大量的双加氧酶粗酶液，方便工业生产用。同时获得的粗酶液可W裂解 叶黄素产生0紫罗兰酬，叶黄素的转化率为70%，通过气相检测最终酶促反应液中0紫罗 兰酬的浓度为0. 02g/L。 本专利技术的技术方案是： 一种微生物双加氧酶粗酶液的制备方法，它的步骤如下： (1)从固体平板上挑取分散泛菌单菌落，接种到种子液培养基上，在抑=6. 4,28°C， 15化/min的条件下振荡培养10-18h，获得种子液； (2) 将种子液按体积比2%的接种量从种子液中接种到发酵培养基中，置于28°C摇床 中，在抑=6. 4,15化/min的条件下培养96-100h，获得发酵培养液； (3) 将发酵培养液在4°C，60(K)r/min下离屯、30min，收集发酵液的上清液，得到粗酶 液。 所述步骤（1)中种子液培养基的配方：蛋白腺12.Og、酵母膏6.Og、化CIO. 8g、蒸馈 水1L。 所述步骤（2)中的发酵液培养基配方：葡萄糖12.Og、酵母膏6. 0g、M拆〇4〇. 15g、叶 黄素 0.02g、Tween-80 1.5ml、蒸馈水 1L。 所述分散泛菌是化/7拉63扣邱ersaATCC29922。 利用微生物双加氧酶粗酶液制备0 -紫罗兰酬的方法，它的步骤如下： (1) 将叶黄素溶于20ml的丙酬中，制成浓度为0.02g/l-lg/L的叶黄素溶液，调节抑到 6. 4 ; (2)取Iml叶黄素溶液于试管中，加入3. 5血抑6.5的0.02mol/L胞2册〇4和0.02mol/ L巧樣酸缓冲液，加入500ul的0. 05mol/L FeS〇4溶液，混匀，加入Iml的粗酶液，置于35°C 培养箱中，避光反应lOmin，得到0-紫罗兰酬。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用微生物发酵方法获取双加氧酶粗酶制剂，并 利用该粗酶液裂解叶黄素生产香味物质P紫罗兰酬。整个工艺流程不仅简单，而且成本 低，催化合成的产物P紫罗兰酬在食品和烟草行业广泛使用。将酶促反应的体积扩大到5 以酶促反应后的溶液中0 -紫罗兰酬浓度可W达到0. 02g/L。【附图说明】 阳01引图1为叶黄素降解产物GC-MS分析图。【具体实施方式】 阳〇1引实施例1 从固体平板上挑取分散泛菌单菌落，接种到种子液培养基上，种子液培养基的配方：蛋 白腺12.Og、酵母膏6.Og、PfeClO. 8g、蒸馈水1L，在抑=6. 4,28°C，ISOr/min的条件下振荡 培养10-18h，获得种子液；将种子液按体积比2%的接种量从种子液中接种到发酵培养基 中，发酵液培养基配方：葡萄糖12.Og、酵母膏6.Og、M拆〇4〇. 15g、叶黄素0. 02g、Tween-80 I. 5ml、蒸馈水比，置于28°C摇床中，在抑=6. 4,15化/min的条件下培养96-100h，获得发 酵培养液；将发酵培养液在4°C，600化/min下离屯、30min，收集发酵液的上清液，得到粗酶 液，保存于4°C。 分散泛菌（化別oea化wersa)保藏于美国模式培养物集存库（Americantype州hurecollection)，保藏号为ATCC29922。 阳〇1引实施例2 利用粗酶液裂解叶黄素生产P-紫罗兰酬的步骤： (1)反应底物叶黄素采用乙醇进行溶解，具体底物的溶解过程：称取0. 02g的叶黄素， 在37°C下溶于20ml的丙酬中，采用氮吹仪进行吹干后，用抑为6. 4的憐酸钟缓冲液定容到 20ml，调节抑到6. 4,得到叶黄素溶液，作为底物。底物浓度为0. 02g/l-lg/L; (2) 粗酶反应液：取ImL步骤（I)中的叶黄素溶液于50ml的具塞试管中，加入3. 5mL 抑6.5的0. 02mol/L胞2册〇4和0. 02mol/L巧樣酸缓冲液，加入500ul的0. 05mol/LFeS04 溶液，混匀，加入Iml的粗酶液，置于35°C培养箱中，避光反应IOmin; (3) 设置空白对照组1 :W煮沸失活的粗酶液代替步骤（2)中的粗酶液，其他溶液和反 应条件不变； (4) 设置空白对照组2 :WP册.4的憐酸缓冲液代替步骤（2)中的粗酶液，其他溶液和 反应条件不变； (5) 反应结束后，将3组反应液都定容至IOmU于分光光度计448nm波长下测吸光度， 计算反应后叶黄素的量。 (6)叶黄素标准曲线的绘制配制的6个梯度的标准溶液根据建立的色谱条件进行 LC-MS分析后，W标样峰面积（Al) /内标峰面积（A,)为纵坐标（内，质量浓度为横坐标（尤， 绘制标准曲线。 叶黄素降解率计算公式(7)确定粗酶反应液中的叶黄素含量减少后，将反应液采用二氯甲烧进行萃取=次，利 用旋转蒸发仪进行浓缩到Iml后进行GC-MS测定反应产物，见图1。 (8)气相（GC)条件如下：气相条件：色谱柱出P-5(30mX0. 25mm;0. 25rm);升溫程 序：初始溫度 45°C，保持 2min，W4°C/min升到 120°C，保留 2min，WTC/min升到 160°C， 保留 5min，W3°C/min升到 200°C，W5°C/min升到 280°C，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物双加氧酶粗酶液的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：（1）从固体平板上挑取分散泛菌单菌落，接种到种子液培养基上，在pH=6.4，28℃，150r/min的条件下振荡培养10‑18 h，获得种子液；（2）将种子液按体积比2%的接种量从种子液中接种到发酵培养基中，置于28℃摇床中，在pH=6.4，150r/min的条件下培养96‑100 h，获得发酵培养液；（3）将发酵培养液在4℃，6000r/min下离心30min，收集发酵液的上清液，得到粗酶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶建斌，杨雪鹏，毛多斌，赵越，张展，马科，胡仙妹，邵化，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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