一种芽孢杆菌(Bacillus sp.) ZY及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及一种芽孢杆菌(

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY，还涉及上述的菌株在抑制冬枣轮纹病中的应用。
技术介绍
随着人们对食品安全的日益重视，可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到各国政府和植物保护专家的重视。生物防治以生态学为基础来控制有害生物，是综合防治体系中一个必不可缺少的组成部分。它避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，避免了农药残留对人畜的危害。应用生物农药取代化学农药已逐渐成为一种趋势。然而，随着生防菌研究的广泛开展，新菌发现越来越难。贝壳堤是由生活在潮间带的贝类死亡之后的壳体及碎屑，经波浪搬运，在高潮线附近堆积而成的。黄河三角洲滨州市无棣、沾化海岸近五六千年以来成陆过程中形成的贝壳堤，生态环境独特，与美国易斯安娜州和南美苏里南的贝壳堤并称为世界三大古贝壳堤，而且是世界上规模最大、惟一的新老并存的贝壳堤。贝壳堤独特的生态环境赋予了该地区特有的生物资源，为发掘新的生防细菌和开发生物农药提供了良好的资源。芽孢杆菌种群庞大，繁殖能力强，耐热、耐酸碱、理化性质稳定，抑菌谱广泛，在植物病害生物防治中占有重要地位，是主要的生防菌种，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspotymyxa)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)等。国内外对芽孢杆菌的研发已投入生产实践，做成商品制剂，取得了高效的生防效果，实验了作物增产。加快生物农药的研发和应用，符合我国农业发展的需要，对于保障人们的饮食健康具有重要意义，发展前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对冬枣轮纹病日益严重的问题，提供一株对冬枣轮纹病菌有抑制作用的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY产生的发酵培养和产生的活性物质的制备方法及其在冬枣轮纹病防治中的应用。本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株，于2013年04月19日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.7490，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株分离自贝沙堤岛滩涂土样中，在LB培养基平板上菌落较大、圆形、隆起、不透明；幼龄菌表面光滑，边缘整齐、产黏液，培养48h以上菌落表面呈现白色褶皱。经生理生化和16SrRNA序列分析表明，该菌株属于芽孢杆菌。使用LB液体培养基对芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株进行发酵培养，用接种环从LB平板挑取ZY单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mlLB培养基的1L锥形瓶中，37℃200rpm，培养3.5d得到发酵液。芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株的LB发酵液经10000rpm离心20min，微孔滤膜过滤后，得到发酵液上清。经对峙实验证明，活性物质存在与发酵液上清中，使用饱和硫酸铵沉淀法提取发酵液上清中的活性物质，该活性物质对冬枣轮纹病菌具有良好的抑制效果。通过定性和定量分析，结果表明芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株产生的活性物质主要由糖类和蛋白质组成，含量分别是67.1%和20.8%。该菌株为革兰氏阳性菌，短杆状，产芽孢，中生或端生；在LB培养基平板上菌落较大、圆形、隆起、不透明。该菌株的幼龄菌表面光滑、边缘整齐、产黏液，培养48h以上菌落呈白色褶皱。生长温度4~55℃，NaCl耐受范围是0~7%。能利用麦芽糖、乳糖、山梨醇和果糖，不利用L-天冬氨酸、肌酸。该菌株接触酶实验、V-P实验、西蒙氏实验、淀粉水解试验、明胶液化实验均为阳性，甲基红实验、纤维素水解实验、酯酶实验、葡萄糖氧化发酵实验为阴性。本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供的CGMCCNo.7490菌，是一种优良的生防芽孢杆菌，有效的提取了该菌株发酵液中的活性物质，该物质对冬枣轮纹病菌有良好的抑制作用。附图说明图1是芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液对冬枣轮纹病病菌的抑制作用；图2是芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液中活性物质对冬枣轮纹病病菌的抑制作用。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式来对本专利技术作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本专利技术，但并不以此限制本专利技术。实施例1本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株的发酵培养发酵培养基即为LB液体培养基（组成为g/L：酵母浸出膏5g；蛋白胨10g；NaCl10g；蒸馏水1000mL；）。用接种环从LB平板挑取ZY单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mLLB培养基的1L锥形瓶中，37℃200rpm，培养3.5d得到发酵液。实施例2本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液对冬枣轮纹病菌的抑制作用将实施例4中的发酵产物经10000rpm离心20min，将上清液用灭菌的0.22μm的微孔滤膜过滤，得到发酵液上清。先用打孔器在活化好的冬枣轮纹病真菌平板上打孔，将菌饼转移至PDA平板中央，培养48h，再将灭菌后的牛津杯放置于平板相应位置，吸取200μl纯化后的发酵液上清缓缓地加入到牛津杯中，整个过程应防止牛津杯内液体渗漏。最后，将对峙平板置于28℃恒温培养箱中，培养12h，结果如图1所示。从图中可以看出ZY的发酵液上清对冬枣轮纹病菌的生长具有明显抑制作用。实施例3本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液中活性物质的提取将得到的发酵液上清使用饱和硫酸铵沉淀法做进一步的提取，得到的ZY的发酵液上清为370mL。向发酵液上清中缓缓加入190.92g固体硫酸铵粉末，（整个过程在冰浴中进行），出现大量絮状沉淀，放在4℃冰箱中过夜后，10000r/min离心20min，弃上清，得到沉淀物。将沉淀物先用少量的蒸馏水冲洗，再用适量蒸馏水回溶，透析后冷冻干燥，得到0.18g活性物质干粉，得率为0.36g/L。实施例4本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液中活性物质与冬枣轮纹病对峙的结果将实施例3中得到的活性物质溶于蒸馏水中，浓度为10mg/ml，进行对峙实验（同实施例2），将对峙平板置于28℃恒温培养过夜，结果如图2所示。表明有效提取了菌株ZY产生的活性物质，对冬枣轮纹病有良好的抑制作用。实施例5本专利技术提供的芽孢杆菌（Bacillussp.）ZY菌株发酵液中活性物质的定性和定量分析采用硫酸-蒽酮法、茚三酮显色、钼酸铵-高氯酸显色法对实施例3中得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芽孢杆菌(Bacillus sp.) ZY菌株，于2013年4月19日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ，其保藏号为CGMCC No.7490；所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) ZY菌株，使用LB液体培养基进行发酵培养，用接种环从LB平板挑取ZY单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mlLB培养基的1L锥形瓶中，37℃ 200rpm，培养3.5d得到发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY菌株，于2013年4月19日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.7490；
所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY菌株，使用LB液体培养基进行发酵培养，用接种环从LB平板挑取ZY单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mlLB培养基的1L锥形瓶中，37℃200rpm，培养3.5d得到发酵液。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY菌株，其特征在于，所述的发酵液经10000rpm离心20min，微孔滤膜过滤后，得到发酵液上清液；所述的上清液中存在活性物质。
3.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY菌株，其特征在于，使用饱和硫酸铵沉淀法提取发酵液上清中的活性物质，该活性物质在抑制冬枣轮纹病菌中的应用。
4.如权利要求3所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)ZY菌株，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：范延辉，王君，姚志刚，石东里，
申请(专利权)人：滨州学院，
类型：发明
国别省市：山东;37