尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8(保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2015072)及其筛选方法和应用。本发明专利技术的尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8筛选方法，建立了尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8筛选的培养基配方，初筛培养基中特别添加了山药，并对微量元素的配制进行了创新。通过本发明专利技术技术体系筛选出的菌株Pseudomonas sp.MHJY8的尼古丁降解活性较高，是良好的诱变育种野生出发菌株，另外，从土壤中筛选的Pseudomonas sp.MHJY8更容易定殖土壤，有利于与烟草栽植生产相结合。该功能菌株进一步丰富了降解尼古丁野生菌的基因遗传资源，存在较大的开发应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。
技术介绍
尼古丁(Nicotine)，又称烟碱，是重要的生物碱之一，主要存在于茄科植物中，烟草的尼古丁含量占其总植物碱含量的95％以上，是影响烟草品质的关键性指标之一。通过主动或被动吸烟摄入人体内的尼古丁产生的危害广泛而深刻，不提倡甚至禁止吸烟已经成为全世界的共识。随着人们对健康关注度的不断提高和我国禁烟令适用范围的不断扩大，如何有效控制和降低烟叶中的尼古丁含量，是烟草种植农户和卷烟生产企业无法规避的重要问题，有关方面的研究必将再次成为一个热点。大量的文献报道表明，实现对烟草中尼古丁含量的精确控制是极为困难的。结合烟草种植和卷烟生产工艺特点和现状，通过生物降解的方法仍然是最为可行的策略，国外很早就开始了运用微生物降解尼古丁的研究与实践，并取得了一定的成效。截至目前，通过微生物降解尼古丁的实践普遍存在的问题是：高效降解尼古丁的野生菌株遗传资源匮乏，株型相对单一；大部分菌种活性偏低，实际开发利用潜力不足；很多具有尼古丁降解能力菌株的生理特性不能很好的与烟草栽植现状和卷烟生产工艺相衔接；高活性的尼古丁降解专利菌株偏少，理论研究与实际应用衔接不够。资料显示，尼古丁降解效率最高的菌株主要存在于节杆菌属Arthrobacter和假单胞菌属Pseudomonas中，隶属于其它分类单元的菌种资源活性普遍偏低，难以到达实用效果。本专利技术通过大量的实验实践，筛选出一株具有高效降解尼古丁能力的菌株，进一步丰富了降解尼古丁野生菌株遗传资源，存在较大的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是为解决尼古丁降解菌种较少，降解效率低等难题，提供一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。本专利技术提供一种尼古丁降解菌，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2015072。尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供一种上述尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8在降解尼古丁中的应用。本专利技术再提供一种尼古丁降解菌的筛选方法，包括以下步骤，尼古丁降解菌初筛：称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀，取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10-6，取0.1ml稀释度为10-3～10-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h；尼古丁降解菌初筛菌株划线纯化：用接种环从上述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取生长良好、特征典型的单菌落，在同一所述尼古丁降解菌初筛培养基上进行划线纯化，连续进行3次，将纯化菌株接种于LB斜面培养基上，4℃保藏。进一步的，所述尼古丁降解菌初筛培养基为取酵母提取物2g，山药4g(市售新鲜山药，去皮，研碎)，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml，蒸馏水定容至1000ml，自然pH，培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得。进一步的，所述微量元素混合液为取MgSO4·7H2O1g，MnSO4·H2O0.4g，CuCl2·2H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，蔬菜汁(市售V8蔬菜汁)定容至100ml，即得。进一步的，所述尼古丁降解菌液体培养基为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。进一步的，所述LB斜面培养基为取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，先用900ml蒸馏水溶解，然后用5mol/LNaOH溶液将pH调至7.0，再用蒸馏水定容至1000ml。进一步的，所述尼古丁降解菌为上述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8。进一步的，所述的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8可用于降解尼古丁。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用，建立了尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8筛选的培养基配方，初筛培养基中特别添加了山药，并对微量元素的配制进行了创新。因为山药含有丰富的天然活性多糖，V8蔬菜汁含有丰富的微量元素和生长因子，二者对提高菌体细胞活性和弱势菌株的生长具有很好的辅助作用，培养基的创新对其它菌株的筛选也具有良好的借鉴意义。通过本专利技术技术体系筛选出的菌株Pseudomonassp.MHJY8的尼古丁降解活性较高，是良好的诱变育种野生出发菌株，另外，从土壤中筛选的Pseudomonassp.MHJY8更容易定殖土壤，有利于与烟草栽植生产相结合。该功能菌株进一步丰富了降解尼古丁野生菌的基因遗传资源，存在较大的开发应用潜力。附图说明图1所示为本专利技术尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8的电镜照片。图2所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8菌株生长与尼古丁降解率关系曲线图。图3所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8基于16SrDNA基因序列的系统发育树。图4所示为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8菌株16SrDNA序列扩增结果。具体实施方式下文将结合具体附图详细描述本专利技术具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。1)用于筛选的材料土壤样品：采自漯河市烟草公司烟草种植基地。尼古丁降解菌初筛培养基：酵母提取物2g，山药4g，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml(将MgSO4·7H2O1g，MnSO4·H2O0.4g，CuCl2·2H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，V8蔬菜汁定容至100ml，即得微量元素混合液)，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得尼古丁降解菌初筛培养基。尼古丁降解菌液体培养基：为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。LB斜面培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，先用900ml蒸馏水溶解，同时用5mol/LNaOH溶液将pH调至7.0，再用蒸馏水定容至1000ml。2)尼古丁降解菌的筛选方法及结果称本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尼古丁降解菌，其特征在于，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2015072。

【技术特征摘要】
1.一种尼古丁降解菌，其特征在于，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2015072。
2.一种尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，
尼古丁降解菌初筛：称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀，取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10-6，取0.1ml稀释度为10-3～10-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h；
尼古丁降解菌初筛菌株划线纯化：用接种环从所述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取单菌落，在同一所述尼古丁降解菌初筛培养基上进行划线纯化，连续进行3次，将纯化菌株接种于LB斜面培养基上，4℃保藏。
3.如权利要求2所述的尼古丁降解菌的筛选方法，其特征在于，所述尼古丁降解菌初筛培养基为取酵母提取物2g，山药4g，K2HPO413g，KH2PO44g，(NH4)2SO40.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml，蒸馏水定容至1000ml，培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙会忠，王小东，朱金峰，李广良，孙明辉，
申请(专利权)人：孙会忠，
类型：发明
国别省市：河南;41