一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法技术

本发明专利技术公开了一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法，属于微生物或酶领域，所述菌株具体为假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)CSY‑67，保藏编号为CGMCC No.13154。该菌株通过液体50L罐深层发酵，经补料，发酵培养80h，产酶平均水平为39575U/mL。本发明专利技术建立的液态发酵海藻糖合酶的方法，生产的海藻糖合酶最适pH范围为7.5‑8.5，最适作用温度范围为35℃‑45℃，在60℃保温1h后剩余酶活为88％，80℃保温2h后剩余酶活为59.5％，具有良好的耐热性，可广泛应用海藻糖的工业化生产中。

【技术实现步骤摘要】
一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
本专利技术属于微生物或酶领域，具体涉及一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法。
技术介绍
海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重要的生物学意义，它是能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，还是某些细菌细胞壁的组分之一。由于海藻糖具有甜度适中、性质稳定、不易分解、无还原性等特殊性质，以及其保护生物大分子(生物膜、蛋白质、DNA)免受干燥、高温、低温、过氧等环境压力破坏的独特功能，因此该双糖的应用价值十分巨大，已经被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。海藻糖合酶(trehalosesynthase)是由日本生化研究所在1995年首次发现的，其能直接将麦芽糖转化为海藻糖，此后，在脂肪杆菌(Pimelobactersp.R48)、恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaH262)和一些嗜热菌中都发现了海藻糖合酶，可喜的是该酶能特异性的催化麦芽糖转化为海藻糖，不作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽寡糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽寡糖等。但是由于受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术海藻糖合酶仍不能满足工业生产的需求，所以选育一株高产海藻糖合酶的假单胞菌菌株，其发酵产品具有良好的耐热性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法，在确保假单胞菌发酵高产海藻糖合酶稳定性的同时，显著提高海藻糖合酶良好的耐热性。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，所述菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)CSY-67，菌株保藏号为CGMCCNo.13154。所述假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃。本专利技术的另一目的在于提供上述假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；种子罐培养：将二级种子液按照接种量5％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速200-800r/min条件下培养14-18h；发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温37℃，转速200-800r/min，设置通风量：0h至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75-85h，得到最终发酵液；将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。进一步地，所述固体斜面培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏6，琼脂15，氯化钠1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20min；所述种子培养基(g/L)：麦芽糖浆40，蛋白胨5，酵母膏5，硫酸钠0.8，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钠0.5，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20min；所述种子罐培养基(g/L)：麦芽糖浆40，葡萄糖10，酵母膏15，玉米浆5，KH2PO41.5，氯化钙0.1，pH7.0，121-123℃灭菌30min；所述发酵罐培养基(g/L)：麦芽糖80，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钾0.3，pH7.0，121-123℃灭菌30min；所述补料瓶培养基(g/L)：麦芽糖浆450，KH2PO45，玉米浆8，CaCl25，pH4.0，121-123℃灭菌30min。所述海藻糖合酶的提取与精制方法如下：先将最终发酵液加1％甲苯进行细胞破壁处理，再加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；在所述浓缩液中加入质量百分比20％(m/v)稳定剂、0.45％(m/v)防腐剂，调节pH7.5，然后进行过滤除菌，即得到海藻糖合酶成品液体酶制剂。优选地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1；2的山梨酸钾和苯甲酸钠。进一步地，所述的提取与精制方法制得的海藻糖合酶成品液体酶制剂产品。本专利技术所述的假单胞菌(Pseudomonassp.)CSY-67是通过对假单胞菌原始菌株CAO12进行常温常压等离子体诱变的得到的，所述的假单胞菌CSY-67已于2016年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13154，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为假单胞菌(Pseudomonassp.)。本专利技术所述高产海藻糖合酶菌株：所述假单胞菌CSY-67的菌落形态特征如下：圆形、乳白色、周边整齐、呈凸透镜状、表面光滑、有色泽、不透明、有臭味。有益效果：本专利技术通过对假单胞菌原始菌株CAO12进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产海藻糖合酶的突变菌株，并对假单胞菌CSY-67发酵过程进行补料条件优化使其最终发酵液中酶活达到39000U/mL至40000U/mL之间，通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂的酶活达到200000U/mL至210000U/mL之间。而假单胞菌原始菌株CAO12通过液态发酵后发酵液中最高酶活为36100U/mL。由此可以看出，假单胞菌CSY-67显著高于假单胞菌原始菌株CAO12的酶活。本专利技术菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。假单胞菌CSY-67发酵得到的海藻糖合酶最适pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃，在60℃保温1h后剩余酶活为88％，80℃保温2h后剩余酶活为59.5％，具有显著的耐热性，可广泛应用于高温工业生产中，显著地拓展了海藻糖合酶的工业应用范围，提高了海藻糖合酶的应用价值。附图说明图1：不同pH下的相对酶活；图2：不同温度下的相对酶活；图3：80℃下保温0-3h后的相对酶活。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。实施例1假单胞菌CSY-67发酵产酶及其所产海藻糖合酶的提取精制方法假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH为7.5，最适作用温度范围为35℃。假单胞菌CSY-67的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，其特征在于：所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)CSY‑67，菌株保藏号为CGMCC No.13154。

【技术特征摘要】
1.一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，其特征在于：所述菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)CSY-67，菌株保藏号为CGMCCNo.13154。2.如权利要求1所述一株高产海藻糖合酶的假单胞菌，其特征在于：所述假单胞菌CSY-67发酵所产的海藻糖合酶最适作用pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为35℃-45℃。3.如权利要求1-2任一所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：斜面培养：挑取一环假单胞菌CSY-67接种于固体斜面培养基，37℃下恒温培养48h，得一级种子；摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温37℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；种子罐培养：将二级种子液按照接种量5％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温37℃，转速200-800r/min条件下培养14-18h；发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温37℃，转速200-800r/min，设置通风量：0h至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.5，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75-85h，得到最终发酵液；将最终发酵液通过提取与精制方法，获得海藻糖合酶成品液体酶制剂。4.如权利要求3所述的高产海藻糖合酶的假单胞菌的发酵产酶方法，其特征在于：所述固体斜面培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏6，琼脂15，氯化钠1，余量为水，pH7.0，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，刘文龙，曹世源，张杰，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37