一种低血清羊水细胞培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI 1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(Alpha Tocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween 80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。本发明专利技术羊水细胞培养基培养相比现有公开技术，不仅降低了血清含量和成本，而且效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，在较短的时间内，可以培养得到大量的处于分裂期的羊水细胞，能够满足临床诊断和科研的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种低血清羊水细胞培养基。
技术介绍
产前诊断是优生学的重要组成部分，它是建立在遗传咨询基础上通过产前检测胎儿健康情况，对患有严重遗传病、先天畸形的患儿可以及早采取措施，减少人群中有害基因积累，以减少患儿出生，提高人口素质，因此具有十分重要的意义。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材、孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法，但孕中期羊水细胞检查仍是最主要的诊断方法。羊水穿刺检查的合适对象为高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸型、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。其中，高龄孕妇是主要检查对象。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及性染色体异常等染色体方面的疾病。成功的羊水细胞培养，除需要严格的实验操作技术和经验外，培养基的组成也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脱落的细胞,其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％),而活力细胞又以贴壁型细胞为主。如何能促其在体外培养中贴壁增殖，是成功培养羊水细胞的关键因素。传统的羊水培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基培养的成功率低,成功率低于30％，而且平均培养周期长,培养周期需要20天,且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在基础培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如ChangHC提供的配方如下：在DMEM与F12按1：1混合的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子，分别为：转铁蛋白(transferrin)5mg/L、亚硒酸钠20nMol/L、胰岛素(insulin)10mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.1nMol/L、胰高血糖素(glucagon)1mg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ug/L、氢化可的松(hydrocortisone)1nMol/L、睾酮(testosterone)1nMol/L、雌二醇(estradiol)1nMol/L、孕酮(progesterone)1nMol/L。ChangHC把含此10种促生长因子配方的培养基称为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-1培养基。生长因子加倍的H-1培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-1在培养基添加较低含量的胎牛血清的情况下，依然能够显著增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生长速度，使培养成功率达到99％以上。按ChangHC配制的羊水细胞培养基在实际运用上依然存在克隆数目较低、克隆增殖较慢、收获的分裂相细胞仍较少等问题。当种植的羊水样品状况不佳时,无法在短期内生成足够的分裂相细胞，与临床检验单位的需求仍有一定差距。中国专利申请CN101705207B公开了一种羊水细胞培养基，该专利申请通过在H-1培养基的基础上添加不同种类的抗氧化剂组合，从而能促进羊水细胞的增殖。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在低血清含量(1％)的羊水细胞培养基新配方，相比现有公开文献报道的配方配制的培养基，能更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期,获得更多的分裂相染色体数目且成本更低。本专利技术的技术方案为：一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(AlphaTocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清。所述胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。优选地，所述低血清羊水细胞培养基各组分含量如下:进一步地，本专利技术低血清羊水细胞培养基可用于产前诊断的贴壁型羊水细胞生长。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术的多次试验改进羊水细胞培养基各组分及其含量最终配制而成，获得出乎意料的效果，相比现有公开技术，效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，在相同的培养时间内，可以培养得到比现有培养基多2～3倍数量的处于分裂期的羊水细胞，能够满足临床诊断和科研的要求，其次本专利技术各组分改进后大大降低了胎牛血清含量，进而可获得较高纯度的羊水细胞，提高临床诊断的准确性。2、本专利技术提供的各组分确定的羊水细胞培养基相比现有公开技术，降低了胎牛血清含量，降低了成本，有利于规模化应用。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述。实施例：配制本专利技术低血清羊水细胞培养基(代号HN-1)：取RPMI1640培养基干粉5.0g、αMEM培养基干粉5.1g，用950ml的超纯水溶解后，添加NaHCO32.0g、柠檬酸铁5mg、重组人胰岛素(Insulin)10mg、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)30ug、重组人表皮细胞生长因子(EGF)10ug、牛血清白蛋白(BSA)2.0g、氢化可的松(hydrocortisone)2nMol、α生育酚(AlphaTocopherol)1mg、乙醇胺1mg、油酸、亚油酸各1mg，其后加吐温80(Tween80)0.5ml、胎牛血清(FBS)10ml，混匀后加超纯水定容至1000ml，即为HN-1羊水细胞完全培养基。无菌分过滤分装，-20℃贮存备用。对比例：配制现有公开专利技术专利CN101705207B披露的羊水细胞培养基(代号为DF-J1)：1L装量的DMEM/F12细胞培养基,用950ml的超纯水溶解后，添加NaHCO31.2g、15mMHEPES，添加10种生长因子，包括转铁蛋白(transferrin)10mg/L、亚硒酸纳40nMol、胰岛素(Insulin)20mg、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.2nMol、胰高血糖素(glucagon)2mg、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ug、氢化可的松(hydrocortisone)2nMol、睾酮(testosterone)2nMol、雌二醇(estradiol)2nMol、孕酮(progesterone)2nMol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低血清羊水细胞培养基，其特征在于，在基础培养基RPMI 1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(Alpha Tocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween 80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清。

【技术特征摘要】
1.一种低血清羊水细胞培养基，其特征在于，在基础培养基RPMI1640/α
MEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤
维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、
氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(AlphaTocopherol)、NaHCO3、
柠檬酸铁、吐温80(Tween80...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海军，吴家波，
申请(专利权)人：广州和能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44