本发明专利技术公开了一种偶联原位萃取发酵红曲黄色素的双液相发酵方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术通过发酵培养基中的碳、氮源的种类及含量能有效控制红曲菌生物合成色素的途径，使红曲菌所生成的橙色素不再转化为红曲红色素；另一方面，双液相萃取发酵偶联体系可保证红曲菌的正常生长和发酵，有助于提高溶氧水平，并可促进红曲色素分泌到细胞外，降低红曲发酵产物的负反馈抑制作用，从而可大幅提高红曲黄色素的发酵水平，缩短发酵时间。发酵结束后，产品易于分离。采用本发明专利技术提供的方法，可以大大提高红曲黄色素的产量和生产效率，降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于发酵工程领域。
技术介绍
天然黄色素分为植物提取物和微生物发酵产物。目前能大规模微生物发酵产生的天然黄色素主要是类胡萝卜素和红曲黄色素。红曲黄色素分为二种，一种是红曲素(monascine),另一种是安卡红曲黄素(ankaflavine)。红曲黄色素的最大吸收峰的波长一般在400-440nm。此外市场上还有一种也来自红曲色素但经化学修饰所得的黄色素，即以天然红曲红色素为原料，将其与连二亚硫酸钠在碱性溶液中反应，使红曲红色素内酯水解，同时在色素结构中引入磺酸基，得到“水溶性红曲黄色素”，这种色素的最大吸收峰对应的波长是476nm。从生产方法及色素的结构上看，这种所谓的红曲黄色素是一种半天然的红曲黄色素。利用红曲菌微生物发酵法生产天然红曲黄色素是当前红曲色素行业的研究开发重点。为提高红曲黄色素生产水平，国内外文献报道的论文或专利关注的重点主要集中在高产红曲菌种的诱变筛选及普通发酵工艺条件的改善这二个方面，但收效不大。例如我国马美荣、泰国Yongsmith的科研团队从20世纪90年代以来通过诱变选育到了单产黄色素的红曲菌，应用于液态发酵和固态发酵生产红曲黄色素。该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是370nm。但液态发酵法黄色素生产水平非常低，至今尚未实现工业化生产。该菌固态发酵12天生产的红曲黄(米)色价达到2224.63U/gdw，虽然色素生产水平较高，但发酵时间过长。国内周波等人通过诱变选育出了红曲黄色素产生菌，该菌株生产的红曲黄色素的最大吸收峰对应的波长是410nm，液态发酵7天的发酵液黄色素色价值仅达110U/mL。以上几例由于发酵色素浓度偏低，发酵时间偏长，均不符合工业化生产的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供，是将红曲菌液体种子接入发酵培养基中，发酵产红曲黄色素；所述发酵培养基是水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。所述红曲菌种是能够产红曲黄色素的红曲菌种。所述基本培养基含有玉米淀粉20_80g/L，黄豆粉0.05_10g/L，硫酸铵3_10g/L，NaN032-6g/L,酵母膏 0.05_5g/L，玉米浆粉 0.05_10g/L，硫酸锌 0.1-0.5g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾 0.5-1.5g/L。所述萃取相中的甘油酯类物质作为萃取剂有提高溶氧的作用，可将附着在发酵液中及红曲菌球表面的色素萃取富集到萃取剂相中，大幅度提高红曲液态发酵合成黄色素产物的浓度和产率。所述甘油酯类物质是甘油三酯类物质，用量体积占基本培养基体积的10-40%。所述甘油三酯类物质是三辛酸甘油酯、三异辛酸甘油酯、植物油或其混合物。除植物油类外，其余甘油三酯类物质添加时间均在红曲种子液接种后24-72h之后。所述甘油酯类物质除甘油三酯类物质，同时还包括甘油二酯类物质、甘油单酯类物质或其混合物。所述甘油二酯类物质、甘油单酯类物质的添加时间为红曲种子液接种24-72h之后。单独添加甘油二酯类物质或甘油单酯类物质时，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5% ;混合添加时，总体积占基本培养基体积的0.1-5%。所述甘油二酯类物质是1，3-甘油二酯、1，2-甘油二酯、二辛酸甘油酯或其混合物。所述甘油单酯类物质是单辛酸甘油酯。所述发酵产红曲黄色素的条件优选将处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比5-10%的接种量接入装有10mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为80?180r/min，温度26?32°C条件下，摇瓶发酵培养4-6d。会抑制菌体生长的部分甘油三酯类物质、甘油二酯、甘油单酯的添加时间为红曲种子液接种后24?72h。红曲菌发酵时首先合成橙色素，红曲橙色素的代谢分为二个分支途径，一条途径橙色素被还原为红曲黄色素，另一条途径则与水相中的氨基酸转化为水溶性能更佳的红曲红色素。如果阻断红曲橙色素被转化为红曲红色素，所生成的橙色素就可能大部分甚至全部转化为红曲黄色素。本专利技术通过设计合理的碳氮源组分、控制培养基中游离氨基酸的含量以及双液相发酵体系，阻断红曲橙色素向红曲红色素的转化，并将合成的红曲色素迅速富集到萃取相中，从而提高红曲黄色素的生产效率，所得红曲黄色素色价最高可达250U/mL。采用普通的油脂作为双液相发酵体系的萃取剂，一方面因油脂有增加溶解氧的作用，这对于保证供氧，提高色素的产量有益；另一方面采用植物油作为萃取剂，有利于色素作为植物油专用的着色剂。此外，甘油脂类物质能改善菌体细胞膜通透性，使合成的红曲色素及时分泌到菌丝体夕卜，降低红曲色素产物的负反馈抑制作用。本专利技术红曲黄色素的纯度较高，发酵时间短，实现闻效、闻广红曲黄色素，提闻经济效益。【附图说明】图1发酵液中提取的红曲黄色素全波长扫描图【具体实施方式】以下实施例所用菌株和发酵方式按照上述方案所述，采用偶联原位萃取发酵生产红曲黄色素产物，下面进一步说明本专利技术的实施例。黄色素色价的测定方法:(I)发酵液的处理发酵液重量和体积的测定及比例系数的确定:对发酵三角瓶(加塞)本身及加培养基(包括油相)后的三角瓶称重(分别记录为Wtl, W2),得出培养基重量(记录为1);量取培养基体积(V1);计算体积与培养基重量之比例系数(mL/g)。发酵结束后，对发酵瓶及发酵液称重，用水补足至发酵前的重量。将红曲菌发酵液(含油)全部转移到磨浆机中，磨成匀浆。取一烧杯和一把金属勺合并称重，用金属勺取相当于1mL左右的发酵液，再将烧杯+金属勺及样品称重，得出样品的实际重量，并换算成发酵液的体积。取无水酒精约20mL，加入到烧杯中，将发酵液搅拌均匀后，转移到50mL比色管中，再分别二次各取1mL无水乙醇洗涤烧杯，将烧杯内的残余发酵液全部转移到比色管中，并定容到50mL，55°C水浴萃取lh，中间间歇摇2次，水浴结束后冷却至室温根据需要取1mL上述发酵液的酒精稀释液按照上述方法再进行一次稀释。(2)黄色价测定与计算用无水乙醇对上述稀释液根据要求再稀释适当倍数(将OD值控制在0.2-0.8之间)，并以无水乙醇为空白对照在200-600nm范围内进行全波长扫描,测定400_440nm之间峰值的OD值。黄色价=OD42tlnmX总稀释倍数(U/mL)种子培养条件:斜面培养基:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0.lg/L，磷酸二氢钾0.5g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L。液体种子培养基:玉米淀粉20g/L，黄豆粉2.5g/L，硫酸铵3g/L，NaN036g/L,酵母膏2g/L，玉米浆粉2g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾0.6g/L。将红曲菌种转接到斜面培养基中培养，培养温度30°C，培养I周，得新鲜红曲菌，无菌操作，用一定量无菌水从斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比10%的接种量接入装有10mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于30°C恒温摇床中，转速为120r/min，培养2-3d，得到处于生长对数期的红曲种子液。实施例1选择红曲菌JJLY-4A为摇瓶菌种。发酵培养基由基本培养基和萃取相所组成。基本培养基(g/L):玉米淀粉60，黄豆粉2，硫酸铵8，NaN036，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸锌0.2，硫酸镁本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种偶联原位萃取发酵红曲黄色素的双液相发酵方法，其特征在于，是将红曲菌种子接入发酵培养基中，发酵产红曲黄色素；所述发酵培养基是水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许赣荣，毛鹏，张薄博，黄艳，贾虎斌，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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