一种马兜铃酸A快速检测卡及其检测方法技术

本发明专利技术一种马兜铃酸A快速检测卡及其检测方法，属于马兜铃酸A检测技术领域。本发明专利技术的马兜铃酸A快速检测卡外壳内有测试条，由支承背板上依次粘贴样品垫、胶体金(或乳胶颗粒)膜、硝酸纤维素膜和吸水膜所组成；所述胶体金(或乳胶颗粒)膜为含抗马兜铃酸A单克隆抗体胶体金(或乳胶颗粒)标记物的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜横向上有两条检测带，一条为含马兜铃酸A蛋白质偶联物的检测带，另一条为含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带。本发明专利技术的检测方法是应用免疫学的方法直接检测中药材或中成药中的马兜铃酸A残留量；本发明专利技术马兜铃酸A快速检测卡易于制备，使用方便快速，结果准确。

【技术实现步骤摘要】
一种马兜铃酸A快速检测卡及其检测方法
本专利技术涉及一种马兜铃酸A快速检测卡及其检测方法，是一种检测马兜铃酸A的检测器具，属于马兜铃酸A检测

技术介绍
马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物,包括马兜铃酸A、B、C和D等。在我国作为药用的马兜铃科马兜铃属植物包括马兜铃、关木通、广防己、朱砂莲、大叶马兜铃、汉中防己、寻骨凤等，这些中药含有马兜铃酸及其硝基菲类有机酸衍生物或马兜铃内酰胺成分。早期发现此类化合物可以抑制肿瘤细胞，后又发现其具有镇痛、消炎、祛痰、利尿、调节血压等作用以及可预防化、放疗引起的白细胞减少，因此此类中药在临床上得到了广泛的应用。近年来,马兜铃酸的肾毒性已引起广泛关注，各国纷纷对含马兜铃酸的中药采取管制及限制措施。研究表明马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸A或其代谢物马兜铃内酰胺所致。因此,在检测马兜铃酸时,常选择马兜铃酸A为指标性成分。目前,检测马兜铃酸的方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法及酶联免疫分析法等。薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低；高效液相色谱法灵敏度较高、测定准确，是目前测定马兜铃酸最常用的方法，但仪器设备昂贵，对实验人员专业技能要求高。例如：对比文件CN102579961A公开了一种消肿止痛酊中马兜铃酸A的质量控制方法，该对比文件是运用高效液相色谱仪进行检测。对比文件公开了CN103063799A公开了一种龙胆泻肝颗粒有效成分的检测方法，通过高效液相色谱仪对马兜铃酸A的含量进行检测，更有利于降低其毒副作用。因此克服现有技术中存在的问题，建立一种准确可靠又快速方便的检测食品中马兜铃酸A的分析方法是非常必要的。本专利技术拟专利技术一种基于小分子物质马兜铃酸A偶联蛋白质后而具有抗原性的免疫学检测方法，采取免疫学竞争法的原理，结合胶体金(或乳胶颗粒)标记技术和免疫层析法设计的一种快速检测试剂，可快速特异地检测中药材或中成药中的马兜铃酸A。根据检测卡样品检测线(T)和质控线(C)的有无显色来判定样品中的马兜铃酸A含量。反应是利用马兜铃酸A蛋白质偶联物抗原性而建立的一种检测方法，具有特异性强的优点，可避免其它检测方法的假阳性导致的误检问题。同时检测卡操作简单快速，无需特殊的仪器设备，适合现场操作。由于样本量需要少、简便快速，适用于大量样本的筛查。结果准确，灵敏度高，准确率大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能快速检测马兜铃酸A的检测器具，直接应用免疫学的方法检测中药材或中成药中马兜铃酸A的含量，克服现有色谱法检测的操作繁琐等缺点，建立基于免疫学特异性的检测方法。为解决本专利技术的技术问题，所采用的技术方案如下：一种马兜铃酸A快速检测卡包括在长条扁平薄壳状的检测卡外壳和设置在外壳中的测试条；所述检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；所述测试条是多层结构的窄条薄片，由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成；所述支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，所述支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样品垫，所述吸水膜内端与所述样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在所述样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜；所述胶体金膜为抗马兜铃酸A抗体胶体金标记的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上依次设有一条检测带和一条质控带，所述检测带为含马兜铃酸A蛋白质偶联物的检测带；所述质控带为含抗鼠抗体或抗兔抗体的质控带；所述测试条置入检测卡外壳内，所述样品垫正对加样孔，所述硝酸纤维素膜正对检测窗孔。所述胶体金膜也可以为乳胶颗粒膜，所述乳胶颗粒膜为含抗马兜铃酸A抗体乳胶颗粒标记的玻璃纤维膜。优选地，所述检测卡外壳由壳盖与壳座两半联接构成，所述检测窗孔和加样孔开设在所述检测卡外壳壳盖上。优选地，所述长条扁平薄壳状的检测卡外壳由长70mm，宽20mm，厚5mm，薄壳壁厚1mm的工程塑料制成。优选地，所述测试条片长60mm，片宽4mm，厚度2.5mm。优选地，所述支承背板，为聚氯乙烯塑料薄片，厚约0.5mm，长60mm，宽4mm。优选地，所述样品垫为吸水玻璃纤维膜，厚0.5-0.8mm，长20mm，宽4mm。优选地，所述胶体金膜厚0.5-0.8mm,长5mm，宽4mm。优选地，所述硝酸纤维素膜厚0.5mm，长20-25mm，宽4mm；所述检测带和质控带在所述硝酸纤维素膜上横向间隔开排列。优选地，所述吸水膜为吸水纸，厚0.5-0.8mm，长16-20mm，宽4mm。优选地，所述胶体金膜、样品垫及吸水膜与所述硝酸纤维素膜的搭接长度为1-2mm。本专利技术还涉及一种采用上述马兜铃酸A快速检测卡快速检测马兜铃酸A的检测方法，该方法是应用免疫学的方法直接检测待检样品中马兜铃酸A的含量，待检样品为川木通、广防己、关木通等中药材或含有马兜铃酸药材的中成药，具体处理方法如下：①提取样品液：取川木通、广防己、天仙藤、青木香、关木通和马兜铃等中药材磨成细粉，过60目筛(0.30mm孔径)，称取0.5g；中成药如双香排石颗粒、龙胆泻肝丸等1.0g于试管中。以5mL甲醇浸提，超声15min，以4000r/min离心10min取上清液，甲醇重复提取一次，合并两次所得溶液，氮气吹干，以20mL无水甲醇或0.01mol/LPBS溶解残余物，即得马兜铃酸提取液。②检测卡检测：先将所述马兜铃酸提取液从所述加样孔中滴注入所述马兜铃酸A快速检测卡的样品垫上，由于虹吸作用原理，带动所述马兜铃酸提取液及胶体金膜中所含的抗马兜铃酸A抗体胶体金标记物一起向所述硝酸纤维素膜扩散，5-10分钟内观察结果。③检测结果对比：检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在所述加样孔中加入马兜铃酸提取液后，在硝酸纤维素膜上迁移的胶体金标记的抗马兜铃酸A抗体，在测试带上分别与检测带含马兜铃酸A蛋白质偶联物，以及质控带所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体反应，形成棕红色条带。若样品中有待检马兜铃酸A存在，当样品加入后即与质控带所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体发生反应，而不会与检测带241所含的马兜铃酸A蛋白质偶联物反应，从而不显色。主要反应的结果有以下3种情况：a、当检测带和质控带同时显现棕红色印迹带，检测结果为阴性，表示被检测样品中马兜铃酸A含量未超标(≤10μg/g)；b、当检测带不显示颜色，只有质控带显现棕红色印迹，检测结果为阳性，表示被检测样品中马兜铃酸A含量超标(＞10μg/g)；c、当检测带和质控带均不显色，则表明测试条已失效。本专利技术的有益效果：本专利技术能快速、特异地检测中药材或中成药中含有的马兜铃酸A，本专利技术易于制备且节省检测费用，使用方便，检测快速，灵敏度高，结果准确。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术马兜铃酸A快速检测卡外壳及测试条在外壳内的安置示意图；图2为本专利技术的马兜铃酸A快速检测卡的测试条结构示意图；图3为本专利技术的马兜铃酸A快速检测卡的测试条的硝酸纤维素膜上显示印迹示意图；附图标注说明：1、外壳；11、检测窗孔；12、加样孔；2、测试条；21、支承背板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马兜铃酸A快速检测卡，其特征在于：在长条扁平薄壳状的检测卡外壳(1)中设置测试条(2)；所述检测卡外壳(1)表面有检测窗孔(11)和加样孔(12)；所述测试条(2)是多层结构的窄条薄片，由支承背板(21)上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫(22)、胶体金膜(23)、硝酸纤维素膜(24)、和吸水膜(25)所组成；所述支承背板(21)中部叠置粘贴硝酸纤维素膜(24)，所述支承背板(21)一端叠置粘贴吸水膜(25)，另一端叠置粘贴样品垫(22)，所述吸水膜(25)内端与所述样品垫(22)内端各自分别与硝酸纤维素膜(24)搭接，在所述样品垫(22)与硝酸纤维素膜(24)的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜(23)；所述胶体金膜(23)为含抗马兜铃酸A抗体胶体金标记的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜(24)上依次设有一条检测带(241)和一条质控带(242)，所述检测带(241)为含马兜铃酸A蛋白质偶联物的检测带；所述质控带(242)为含抗鼠抗体或抗兔抗体的质控带；所述测试条(2)置入检测卡外壳(1)内，所述样品垫(22)正对加样孔(12)，所述硝酸纤维素膜(24)正对检测窗孔(11)。

【技术特征摘要】
1.一种马兜铃酸A快速检测卡的检测方法，其特征在于，所述马兜铃酸A快速检测卡在长条扁平薄壳状的检测卡外壳(1)中设置测试条(2)；所述检测卡外壳(1)表面有检测窗孔(11)和加样孔(12)；所述测试条(2)是多层结构的窄条薄片，由支承背板(21)上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫(22)、胶体金膜(23)、硝酸纤维素膜(24)、和吸水膜(25)所组成；所述支承背板(21)中部叠置粘贴硝酸纤维素膜(24)，所述支承背板(21)一端叠置粘贴吸水膜(25)，另一端叠置粘贴样品垫(22)，所述吸水膜(25)内端与所述样品垫(22)内端各自分别与硝酸纤维素膜(24)搭接，在所述样品垫(22)与硝酸纤维素膜(24)的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜(23)；所述胶体金膜(23)为含抗马兜铃酸A抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜，所述硝酸纤维素膜(24)上依次设有一条检测带(241)和一条质控带(242)，所述检测带(241)为含马兜铃酸A蛋白质偶联物的检测带；所述质控带(242)为含抗鼠抗体或抗兔抗体的质控带；所述测试条(2)置入检测卡外壳(1)内，所述样品垫(22)正对加样孔(12)，所述硝酸纤维素膜(24)正对检测窗孔(11)；所述抗马兜铃酸A抗体、马兜铃酸A蛋白质偶联物由如下方法制得：1)制备马兜铃酸A免疫抗原和包被抗原：称取80mg马兜铃酸A，加入15mg戊二酸酐并溶于4ml吡啶，室温下反应24小时；然后用氮气吹干，加入8ml二甲基亚砜－二氧六环，二甲基亚砜：二氧六环为1:1，再加入60μL三丁胺，水浴搅拌10分钟，再加入30μL氯甲酸异丁酯，搅拌1小时；冷浴下逐滴加入到70mg溶于pH8.5硼酸盐缓冲液的鸡卵清白蛋白OVA，室温下反应12小时，反应产物用0.01mol/LpH7.5的磷酸盐缓冲液PBS透析3d，冷冻干燥，-20℃保存；2)制备抗马兜铃酸A单克隆抗体：2.1动物免疫：用无菌pH7.5的PBS液将合成的免疫抗原马兜铃酸A-OVA偶联物溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂体积按1:3的比例充分乳化制成油乳剂疫苗；首次免疫用弗氏完全佐剂，对8～10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为100μL/只；14天后采用弗氏不完全佐剂第二次免疫，免疫剂量60μL/只；以后相继免疫4次；第6次免疫后加强免疫，不加佐剂，直接采用生理盐水免疫；2.2细胞融合与培养：将产生马兜铃酸A特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1体积比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清液，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入融合剂聚乙二醇0.8mL，轻轻混匀细胞，静置90Sec，加入DMEM无血清培养基终止反应，加入速度为前2min1ml/min，第3min2ml/min，第4min5ml/min，此时将剩余DMEM倒入离心管，终体积为25～30ml，800rpm离心7min，弃去上清液；用20～50mlHAT培养基重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔150μL；置37℃,二氧化碳体积浓度5％的培养箱中培养；2.3细胞筛选与亚克隆：待细胞长至孔底面积的1/2～1/3时，采用直接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性细胞孔；将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌马兜铃酸A单克隆抗体的杂交瘤细胞株；2.4单克隆抗体的腹水制备和纯化：A.小鼠致敏：液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6～8周，注射体积500μL/只；7天后制备腹水；B.注射...

【专利技术属性】
技术研发人员：周坚，汤朝阳，李云峰，
申请(专利权)人：长沙安迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43