荧光SiO2胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO2胶体试剂的试纸技术

本发明专利技术公开了荧光SiO2胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO2胶体试剂的试纸，制备方法包括制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子；SiO2纳米氨基的羧基化；通过羧基化荧光SiO2纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到荧光SiO2纳米粒子。本发明专利技术的有益效果是：通过制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子、羧基化荧光SiO2纳米粒子和将羧基化LDS粒子与抗体蛋白的偶联来制造荧光SiO2胶体试剂，制作过程简易可行；利用荧光SiO2胶体试剂与免疫层析技术相结合，制备的检测试纸，可以实现定性检测有色和无色样品，扩大了常规胶体金标记试纸的应用领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及荧光SiO2胶体试剂的制备方法及使用荧光SiO2胶体试剂的试纸。
技术介绍
免疫层析技术目前最常用的方法为免疫胶体金层析技术，其基本过程是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。免疫胶体金层析技术自从上世纪70年代被提出以来，已在生物医学，特别是医学检验领域获得了飞跃式发展，目前已有各种试纸条的开发和面市。作为诊断试剂，免疫胶体金试纸条具有结构简单、使用方便、灵敏度和准确度较高等特点。这类试纸条的基本特点是依靠胶体金特殊聚集状态下的颜色对检测结果作出判断，应用的前提是被检物本身的颜色不能干扰胶体金条带的颜色，否则难以对结果作出明确判断。但在实际应用过程中所接触到的大部分待检样品为有色液体，如酿造行业中的酱油、食醋等均具有较深的颜色，大多数农产品和加工食品的提取液也不是无色透明的液体，医学检验时所用人体体液(血清、尿液等)也具有特定颜色，这些待检样本自身固有颜色会掩盖胶体金条带的颜色，严重时无法读取检测结果。因此，为了扩大该技术方法的应用领域和范围，特提出本专利技术，其基本特征是以免疫荧光SiO2纳米粒子胶体代替免疫金胶体，以荧光代替纳米金粒子的自身显色，突破了传统免疫胶体金试纸无法检测有色样品的限制，扩大了应用领域并提高了检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供荧光SiO2胶体试剂的制备方法，以及使用荧光SiO2胶体试剂制作检测灵敏度高、能够检测有色样品的免疫层析试纸。为了达成上述目的，本专利技术采用如下技术方案：荧光SiO2胶体试剂的制备方法包括以下步骤：1)制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子：利用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)、环己烷、正己醇和水形成微乳体系的液体，在微乳体系中加入二氯化三联吡啶钌六水合物([Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O)溶液后搅拌，继续加入正硅酸四乙酯(TEOS)、氨水之后，形成核壳结构，继续加入正硅酸乙酯(TEOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(triethoxysilane)，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子溶液，经过破乳、清洗、干燥后得到荧光SiO2纳米粒子；2)SiO2纳米氨基的羧基化：利用N,N-二甲基甲酰胺对步骤1)中得到的纳米粒子进行清洗、搅拌得到羧基化的荧光SiO2纳米粒子；3)通过羧基化荧光SiO2纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到抗体致敏的荧光SiO2纳米粒子。步骤1)的具体步骤如下：1-1)利用Triton-X100、环己烷、正己醇和水在搅拌设定时间后形成微乳体系；1-2)在步骤1-1)得到的微乳体系中加入浓度为100mg/ml的[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O水溶液后，进行搅拌，[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O水溶液与步骤1-1)中加入水的体积比是1:2；1-3)在步骤1-2)得到的溶液中加入与步骤1-2)中[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O同体积的TEOS后进行搅拌，加入氨水后，在室温条件下，搅拌，使得溶液中形成核壳结构，进行静置；1-4)向步骤1-3)中得到的溶液中加入步骤1-3)中TEOS体积3/5的TEOS和步骤1-3)中TEOS体积3/5的triethoxysilane，在室温条件下，继续搅拌后，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子；1-5)在步骤1-4)中得到的溶液中加入丙酮，进行破乳，分别用乙醇和PBS(pH＝6.8)对破乳后的溶液清洗数次，得到纳米粒子，将得到的纳米粒子真空冷冻干燥。步骤2)的具体步骤如下：2-1)将步骤1)中得到的SiO2纳米粒子，在氮气的保护下，加入质量浓度在8％-15％的琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液；2-2)持续通氮气，连续搅拌反应，得到离心的羧基化SiO2纳米粒子；2-3)将步骤2-2)得到的离心的羧基化SiO2纳米粒子沉淀，对其充分干燥。步骤3)的具体步骤如下：3-1)取设定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液使之充分溶解，形成I液；3-2)取设定质量的羧基化的荧光SiO2纳米粒子，用PBS溶液溶解，形成II液；3-3)取待标记抗体蛋白,溶于PBS中，形成III液；3-4)将步骤3-2)获得的II液和步骤3-3)获得的III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入步骤3-1)获得的部分I液；3-5)在室温条件下，对步骤3-4)获得的溶液在避光条件下，继续逐滴加入余下的I液；3-6)在4℃的条件下，对步骤3-5)获得的溶液搅拌；3-7)在4℃的条件下，对步骤3-6)获得的溶液静置；3-8)用设定浓度的PBS溶液对3-7)获得的物质清洗三次，干燥后，获得抗体致敏的荧光SiO2胶体试剂。步骤1-1)中Triton-X100、环己烷、正己醇和水的体积比是17.7:75:16:2。步骤3-1)中的EDC的质量与所述步骤3-2)中荧光SiO2纳米粒子的质量比是4:1。荧光SiO2胶体免疫层析试纸的装配：在底衬上依次贴下端样品吸收垫、硝酸纤维素膜和上端样品吸收垫，底衬为透明PVC底衬，在下端样品吸收垫与硝酸纤维素膜之间搭接荧光SiO2胶体结合垫，在硝酸纤维素膜上设有两条平行的检测线T和质控线C，在下端样品吸收垫上依次设置检测液面下线和检测液面上限，用于使用时提示操作者正常的浸渍范围。在所述荧光SiO2胶体结合垫内含有对待检物的特异性抗体的致敏荧光SiO2粒子复合物。检测线T包含待检物-BSA(牛血清白蛋白)载体复合物。质控线C内含兔抗鼠IgG二抗。本专利技术的有益效果1)通过制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子、羧基化荧光SiO2纳米粒子和将羧基化LDS粒子与抗体蛋白的偶联来制造荧光SiO2胶体试剂，制作过程简易可行；2)利用荧光SiO2胶体试剂与免疫层析技术相结合，制备的检测试纸，可以实现定性检测和定量检测；3)该试纸能检测有色样品，扩大了应用领域；4)该试纸检测结果条带为荧光显示，故能排除背景颜色的干扰，提高检测的灵敏度，无机SiO2胶体荧光基团性质稳定，发光效率高，耐储存。附图说明图1是本专利技术中试纸结构原理图；图2是本专利技术检测效果图；其中，1.检测液面下限；2.下端样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
荧光SiO2胶体试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子：利用聚乙二醇辛基苯基醚、环己烷、正己醇和水形成微乳体系的液体，在微乳体系中加入二氯化三联吡啶钌六水合物溶液后搅拌，继续加入正硅酸四乙酯、氨水之后，形成核壳结构，继续加入正硅酸乙酯和3‑氨基丙基三乙氧基硅烷，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子溶液，经过破乳、清洗、干燥后得到荧光SiO2纳米粒子；2)SiO2纳米氨基的羧基化：利用N,N‑二甲基甲酰胺对步骤1)中得到的纳米粒子进行清洗、搅拌得到羧基化的荧光SiO2纳米粒子；3)通过羧基化荧光SiO2纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到抗体致敏的荧光SiO2纳米粒子。

【技术特征摘要】
1.荧光SiO2胶体试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备氨基修饰的荧光SiO2纳米粒子：利用聚乙二醇辛基苯基醚、环己烷、正己醇和
水形成微乳体系的液体，在微乳体系中加入二氯化三联吡啶钌六水合物溶液后搅拌，继续
加入正硅酸四乙酯、氨水之后，形成核壳结构，继续加入正硅酸乙酯和3-氨基丙基三乙氧
基硅烷，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子溶液，经过破乳、清洗、干燥后得到荧光SiO2纳米
粒子；
2)SiO2纳米氨基的羧基化：利用N,N-二甲基甲酰胺对步骤1)中得到的纳米粒子进行
清洗、搅拌得到羧基化的荧光SiO2纳米粒子；
3)通过羧基化荧光SiO2纳米粒子与抗体蛋白的偶联，得到抗体致敏的荧光SiO2纳米粒
子。
2.如权利要求1所述的荧光SiO2胶体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的
具体步骤如下：
1-1)利用Triton-X100、环己烷、正己醇和水在搅拌设定时间后形成微乳体系；
1-2)在步骤1-1)得到的微乳体系中加入浓度为100mg/ml的[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O
水溶液后，进行搅拌，[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O水溶液与步骤1-1)中加入水的体积比是1:2；
1-3)在步骤1-2)得到的溶液中加入与步骤1-2)中[Ru(bpy)3]2+Cl-2·6H2O同体积的
TEOS后进行搅拌，加入氨水后，在室温条件下，搅拌，使得溶液中形成核壳结构，进行静
置；
1-4)向步骤1-3)中得到的溶液中加入步骤1-3)中TEOS体积3/5的TEOS和步骤1-3)
中TEOS体积3/5的triethoxysilane，在室温条件下，继续搅拌后，得到氨基修饰的SiO2纳米粒子；
1-5)在步骤1-4)中得到的溶液中加入丙酮，进行破乳，分别用乙醇和设定pH值的
PBS对破乳后的溶液清洗数次，得到纳米粒子，将得到的纳米粒子真空冷冻干燥。
3.如权利要求1所述的荧光SiO2胶体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的
具体步骤如下：
2-1)将步骤1)中得到的SiO2纳米粒子，在氮气的保护下，加入质量浓度在8％-15％的
琥珀酸酐N,N-二甲基甲酰胺溶液；
2-2)持...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜国胜，刁玉涛，张华，刘振东，成丽娟，孙尚文，王舒健，
申请(专利权)人：山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37