【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及lamp检测，特别是涉及一种毛细管改良lamp法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法。
技术介绍
1、
2、当下对于猴痘病毒和基孔肯雅病毒目前尚无批准的相关疫苗和特效药，因此针对这两种病毒的检验检疫工作是防控跨境输入的关键。
3、目前常用的检测技术中，一种是传统的pcr法，一种是环介导等温扩增(lamp)技术。lamp法是一种全新的核酸扩增方法，其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型dna聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，通过肉眼观察是否有白色沉淀产生就能判断靶基因是否存在。lamp法具有简单、快速、特异性强的特点，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于pcr技术，与常规pcr相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本也远低于荧光定量pcr，是一种适合现场、基层快速检测的方法。
4、借助于lamp方法高特异性和高灵敏度、操作十分简单的优势，再加上其反应条件易控，设备简单，非常适合做境外输入性病例的检验检疫，因此受到广泛应用。在实验过程中，实验人员发现，对于引物和待测物质的载体不同，会影响最终的检测结果，因此想通过lamp法对猴痘病毒和基孔肯雅病毒进行检测，还需要对lamp法进行进一步地优化。
5、在实验过程中，实验人员还发现若使用检测实验中常用的ep管进行检测实验时，常会有伪阳性
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种毛细管改良lamp检测法；
2、本专利技术的另一个目的是一种毛细管改良lamp检测法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒。
3、为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：
4、1.配置反应体系：
5、采用bst4.0红黄变色的lamp方法，搭配红色ph指示染料，bst4.0红黄变色标准反应体系为9μl，标准反应体系为：2.5xbst4.0 ls mastermix 4μl、10xlamp primer mix 1μl，在10x引物中加入终浓度1mm naoh使引物恢复到中性ph(ph＝7～8.5)，将引物用ddh2o稀释至10μm，并用ddh2o补足体积到9μl。
6、其中，引物是通过primerexplorerv5软件对mpxv f13和chikv nsp1进行lamp引物设计，由北京擎科生物进行引物合成，引物信息如下:
7、表1.monkeypox virus f13 lamp primer
8、
9、表2.chikungunya virus nsp1 lamp primer
10、
11、具体地，猴痘病毒bst4.0 low salt master mix lamp酶促反应-9μl反应体系包括：2.5xbst4.0 ls master mix 4μl、f13-f3 0.1μl、f13-r3 0.1μl、f13-fip 0.4μl、f13-bip 0.4μl、ddh2o 4μl；
12、具体地，基孔肯雅病毒bst4.0 low salt master mix lamp酶促反应-10μl反应体系包括：2.5x bst4.0 ls master mix 4μl、nsp1-f3 0.1μl、nsp1-r3 0.1μl、nsp1-fip 0.4μl、nsp1-bip 0.4μl、ddh2o 4μl。
13、2.检测：
14、取用不同量程刻度的毛细吸管吸取已提前混好的酶促反应体系中的溶液9μl，然后再吸入相应待测样品1μl，置于65℃恒温箱中孵育30min。
15、3.结果分析：
16、待反应30min后，取出毛细管，肉眼直接观察指示剂颜色变化：由红色变为黄色则检测结果视为阳性；若无变化则为阴性。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、1.lamp检测法已有扎实的实验数据积累，证明该检测方法得到的数据具有真实性和有效性，可取代传统pcr技术，成为一种重要的分子生物学研究工具，再加上lamp技术操作简便、对仪器设备要求不高，完全能够达到境外输入性病例的检验检疫工作要求，不仅如此使用lamp检测法检测结果可直接观察，提高工作效率，减低检测成本。
19、2.使用毛细管取代ep管，并对lamp检测法进行优化可联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒，解决了在高温环境下产生气溶胶污染的问题，在高温环境下，毛细管内物质不会出现被蒸干的现象，使检验结果数据更加稳定，准确性更高；利用ep管使用lamp检测法时，使用的是25μl的检测体系，改用毛细管后，只需使用10μl的检测体系，降低取样量每次仅需吸取1-1.5μl样品即可，并不会影响检测结果的准确性，灵敏度高，可以检测到6个copy甚至更低；并且使用毛细管可以自动吸样，减少实验人员于检测样本的接触时间，不仅如此毛细管还具有便于观察、更换灵活的特性，使优化后的lamp检测法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒。
20、3.虽然目前该检测方法还处于实验室阶段，且本方案只是做了质粒样品的检测，但是可以做出合理预期，该方法能够应用于猴痘病毒和基孔肯雅病毒的实际检验检测工作中，利用该方法可直接用已经吸取好酶促反应体系溶液的毛细管直接吸取血样进行检测，缩短检测时间，提高检测效率；有利于检验检疫工作的进行，降低猴痘病毒和基孔肯雅病毒的暴露风险。
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1.一种毛细管改良LAMP法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述一种毛细管改良LAMP法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系为：2.5xBst4.0 LS MasterMix 4μL、10xLAMPPrimer Mix 1μL，用ddH2O补足体积到9μL。
3.如权利要求2所述一种毛细管改良LAMP法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，所述10x引物需加入终浓度为1mM NaOH调节引物pH为7～8.5，再用ddH2O稀释至10μM。
4.如权利要求2或3所述一种毛细管改良LAMP法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，所述体系中合成引物包括猴痘病毒引物和基孔肯雅病毒引物，其中所述猴痘病毒检测引物氨基酸序列为：
5.如权利要求1所述一种毛细管改良LAMP法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中对酶促反应体系溶液的取样量为9μL，待测样品取样量为1μL。
【技术特征摘要】
1.一种毛细管改良lamp法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述一种毛细管改良lamp法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系为：2.5xbst4.0 ls mastermix 4μl、10xlampprimer mix 1μl，用ddh2o补足体积到9μl。
3.如权利要求2所述一种毛细管改良lamp法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，所述10...
【专利技术属性】
技术研发人员：栾俊文，李道群，程慧祥，张磊亮，黄海燕，
申请(专利权)人：山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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