一种基于2+N策略构建多靶点gRNA表达载体的方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基于2+N策略构建多靶点gRNA表达载体的方法及其应用。本发明专利技术通过PCR获得单gRNA表达模块，并亚克隆至克隆载体中。通过定点突变法快速置换克隆载体中的gRNA碱基序列。通过同源重组的方法一次性串联双gRNA表达模块，双gRNA表达模块之间引入新的限制性酶切位点，构建双gRNA表达载体。利用同源臂上的限制性酶切位点线性化表达载体，在相邻的双gRNA表达模块间添加新的限制性酶切位点，基于同源重组，完成2+N个多gRNA表达载体的构建。此方法适用于构建可以同时表达多个gRNA的表达载体，从而一次性的编辑一个或多个靶基因，在多基因联合作用机制研究中有重要意义。中有重要意义。中有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于2+N策略构建多靶点gRNA表达载体的方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种基于2+N策略构建多靶点gRNA表达载体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]基因编辑，是一种新兴的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。作为生命科学发展迅速的重要研究领域，基因编辑技术的开发及应用使得生物体的遗传改造进入了前所未有的深度与广度。Charpentier和Doudna博士发现CRISPR/Cas系统在基因编辑的机制，并因此获得2020年的诺贝尔化学奖，CRISPR是规律性间隔成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。最初，CRISPR/Cas被发现是细菌用来识别和摧毁噬菌体和其它病原的防御系统，近年来基因编辑技术已经广泛应用于农业，生物，医疗等领域。
[0004]在CRISPR/Cas9系统中，酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于2+N策略获得多gRNA串联表达载体的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：获取单gRNA表达模块，并亚克隆至克隆载体中；通过定点突变快速置换克隆载体中的gRNA碱基序列；设计携带酶切位点的同源臂引物，通过同源重组的方法一次性串联双gRNA表达模块，双gRNA表达模块之间引入新的限制性酶切位点，构建双gRNA表达载体；并利用同源臂上的限制性酶切位点线性化表达载体，设计同源臂引物，在相邻的双gRNA表达模块间添加新的限制性酶切位点，通过同源重组的方法，完成2+N个多gRNA表达载体的构建。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点突变采用Quick Change突变。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：S1、亚克隆gRNA表达模块得到克隆载体
‑
M0；S2、在两个gRNA表达模块克隆载体上分别利用定点突变技术突变不同的sgRNA序列，得到克隆载体
‑
M1和克隆载体
‑
M2；S3、提供线性化gRNA表达载体；在表达模块的上下游获取适宜的酶切位点进行双酶切和/或设计引物运用PCR技术将表达载体线性化；S4、设计引物分别以克隆载体
‑
M1、克隆载体M2为模板利用PCR技术提供两个DNA片段：即第一片段HR1
‑
M1
‑
HR2、第二片段HR3
‑
M2
‑
HR4；S5、将所述HR1
‑
M1
‑
HR2、HR3
‑
M2
‑
HR4和线性化gRNA表达载体混合，进行同源重组反应，并由此产生双靶点gRNA表达载体；S6、同步骤S2的方法，突变gRNA克隆载体，得到第三个克隆载体
‑
M3；S7、提供线性化双靶点gRNA表达载体，具体的，利用步骤S4中HR2上设计的酶切位点进行单酶切反应将双靶点gRNA表达载体线性化；S8、设计引物以克隆载体
‑
M3为模板利用PCR技术提供一个DNA片段：即HR5
‑
M3
‑
HR6；S9、将HR5
‑
M3
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张之勇，付加芳，李佳起，鞠思雨，孙文娟，杨华，陈元，王志毅，成丽娟，刁玉涛，王晰，崔世钰，刘兆锴，
申请(专利权)人：山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：