一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法技术

一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法：将质粒转化到感受态DH5α；对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；稳定表达细胞的筛选；细胞扩增；获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。本发明专利技术利用电转仪解决了Raw264.7细胞难感染，难以构建稳定高表达细胞株的问题，操作简便，可以在短时间内获得稳定高表达某基因的Raw264.7细胞株。Raw264.7细胞株。Raw264.7细胞株。

【技术实现步骤摘要】
一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物技术及基因工程领域，尤其是一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法。

技术介绍

[0002]腹膜透析对于终末期肾病患者来说是一种成功的肾脏替代疗法，而腹膜炎是导致腹膜透析失败甚至患者死亡的主要原因，外界病原体的侵入，诱导巨噬细胞及白细胞等侵入腹膜。
[0003]巨噬细胞是属于吞噬细胞的一种细胞，是人体免疫系统的主要成员之一，能识别不同的病原微生物，并且能够快速做出有效反应,起到清除病原体的作用,是机体抵御外来感染的第一道防线。
[0004]PPARγ即过氧化物酶体增殖物活化受体γ，是一种核激素受体超家族中的脂肪酸激活转录因子，经研究，PPARγ在许多炎症疾病包括腹膜炎，脑损伤中的炎症，肺炎，肠炎，乳腺炎等许多不同部位的炎症中，PPARγ都起着抗炎的作用。因此，通过研究PPARγ是否以外泌体的形式从巨噬细胞中分泌出来，以及进一步研究分泌的PPARγ调控腹膜炎性损伤的机制研究能够从机体防御的角度，为腹膜炎的预防及治疗提供新的思路。
[0005]在该研究过程中，在巨噬细胞Raw264.7细胞中构建PPARγ稳定高表达的细胞株是实验开展的基础，然而，慢病毒感染Raw264.7十分困难，因此，提供一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达PPARγ的细胞株的方法并进行应用是需要解决的一个技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，解决了Raw264.7难感染的问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，包括以下步骤：（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；（2）对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；（3）将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；（4）利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；（6）稳定表达细胞的筛选；（7）细胞扩增；（8）获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。
[0008]慢病毒感染并非平常的感染，而是将包装好的慢病毒颗粒在借助外力的作用下（电转仪），通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的病毒颗粒，实现构建稳定高表达目的基因的细胞株。本专利技术其能够实现目标基因PPARγ的稳定
过表达，进而为在Raw264.7细胞中研究PPARγ的分泌，以及分泌的PPARγ调控腹膜炎性损伤的机制研究提供了实验材料，且该细胞株过表达PPARγ稳定，可以用于定量和定性检测PPARγ过表达状态下相关蛋白质的表达情况。
[0009]作为改进，所述Raw264.7细胞为宿主细胞。
[0010]作为改进，述步骤（3）的具体步骤包括：a）转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，接种于10cm大皿中，37℃、5%CO2培养箱内用10%血清的DMEM培养基培养；b）取2个无菌1.5mL离心管置于离心管架分别A管和B管，取650uLOpti
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MEM 加入到两个离心管，取36μl Lipofectamine 2000于A管中，分别取8ug质粒 3*FLAG
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PPARγ
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EGFP、6μgPLP1、6μg PLP2、6μg VSVG 加入B管中，室温静置5min；c）将长至80%的293T培养基弃掉，PBS清洗后换成Opti
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MEM培养基培养；d）5min后，将A、B两管混合，室温静置20min；e）将A、B混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；f）培养6 h后弃去含有A、B混和物的培养基， PBS清洗，加入含10%灭活血清的DMEM细胞培养基6 ml，于37℃、5% CO2培养箱内继续培养48 h；g）收集上清，1000 rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液用0.45 μm PVDF滤器过滤至5 ml圆底离心管中。
[0011]作为改进，所述步骤（5）的具体步骤包括：a）将长至70%
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80%的两皿Raw264.7细胞拿到安全柜中，吹打下细胞，收集细胞沉淀，230g，3min离心；b）弃上清，PBS清洗一遍，分装为两管，230g，3min离心，弃上清；c）电转缓冲液为PBS和灭活的胎牛血清，用1mL血清/PBS重悬，计数，取5
×
106 个细胞于10 μl病毒浓缩液中吹打均匀，使用电极杯配套吸管加入到2mmBTX电极杯中，设置电压为200V，脉冲长度为8毫秒，脉冲数量为1，脉冲场强为1000V/cm，总样本体积为200
µ
l，温度为室温；d）将电转后的细胞悬液吸出加入含有1mL灭活的胎牛血清的六孔板中，37℃、5% CO2培养箱内中培养。
[0012]本专利技术与现有技术相比所带来的有益效果是：本专利技术提供的方法通过利用电转仪，通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞，从而攻克了Raw264.7难感染的难题，从而能够快速构建稳定高表达目标基因的Raw264.7细胞株，能够通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。
附图说明
[0013]图1为western blot实验结果图I。
[0014]图2为western blot实验结果图II。
[0015]图3为过表达PPARγ后炎症因子下调的实时荧光定量PCR结果图。
具体实施方式
[0016]下面结合说明书附图对本专利技术作进一步说明。
[0017]一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，包括以下步骤：（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；（2）对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；对转化后DH5α进行质粒提取，获得3*FLAG
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PPARγ
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EGFP质粒；（3）将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；以所述3*FLAG
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PPARγ
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EGFP质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液使用PEG8000浓缩方法浓缩，利用电转仪感染Raw264.7细胞后筛选出阳性克隆，培养10天左右，获得稳定高表达PPARγ的细胞株，具体步骤如下：a）转染前24h，观察293T细胞状态，长至90%左右，状态良好；弃旧培养液，加入1mL PBS溶液，缓慢晃动，洗涤细胞，弃去PBS溶液，每皿加入1mL胰酶，消化约30s直到细胞变圆，变亮，弃胰酶，加入2ml LDMEM+10％FBS培养基，用枪吹打数次，将皿底的细胞冲洗下来，收集到5mL离心管中， 230g，3min离心；加入1mL DMEM+10％FBS培养基重选均匀；接种于10cm大皿中，37℃、5%CO2培养箱内培养；b）第二天观察细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态DH5α；（2）对转化后的DH5α扩大培养，提取质粒；（3）将获得的质粒转染293T细胞，获得慢病毒液；（4）利用PTG8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入Raw264.7细胞；（6）稳定表达细胞的筛选；（7）细胞扩增；（8）获得稳定高表达目的基因的Raw264.7细胞株。2.根据权利要求1所述的一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于：所述Raw264.7细胞为宿主细胞。3.根据权利要求1所述的一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体步骤包括：a）转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，接种于10cm大皿中，37℃、5%CO2培养箱内用10%血清的DMEM培养基培养；b）取2个无菌1.5mL离心管置于离心管架分别A管和B管，取650uLOpti
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MEM 加入到两个离心管，取36μl Lipofectamine 2000于A管中，分别取8ug质粒 3*FLAG
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PPARγ
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EGFP、6μgPLP1、6μg PLP2、6μg VSVG 加入B管中，室温静置5min；c）将长至80%的293T培养基弃掉，PBS清洗后换成...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云芳，高学娟，
申请(专利权)人：广州市花都区人民医院，
类型：发明
国别省市：