一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，包括以下步骤：步骤一、DYNLT5RNA干扰慢病毒载体制备；步骤二、DYNLT5在人微血管内皮细胞中的内源性表达；步骤三、慢病毒感染和敲减效率；步骤四、细胞增殖实验；步骤五、细胞周期实验；步骤六、细胞凋亡实验；步骤七、血管生成实验；以DYNLT5基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，构建目的基因RNA干扰慢病毒载体,对人微血管内皮细胞(HMEC)中的DYNLT5基因进行敲减表达，观察微血管内皮细胞的增殖和血管生成情况，完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链DNA，探究DYNLT5基因的新作用，DYNLT5基因具有促进血管生成、组织修复的作用。组织修复的作用。

Application of dynlt5 gene in atherosclerotic plaque and tissue repair

【技术实现步骤摘要】
一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用


[0001]本专利技术属于基因
，具体涉及一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用。

技术介绍

[0002]动脉粥样硬化是一组动脉硬化的血管病中常见的最重要的一种，其特点是受累动脉病变从内膜开始。一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。
[0003]基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)，带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现。组成简单生命最少要265到350个基因。(这涉及基因工作组的力量，人类的基因工作组与果蝇的基本相似)。
[0004]本专利技术提出了一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，探究DYNLT5基因的新作用，DYNLT5基因具有促进血管生成、组织修复的作用。

技术实现思路
/>[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，以解决上述
技术介绍
中提出的的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，包括以下步骤：
[0007]步骤一、DYNLT5RNA干扰慢病毒载体制备；
[0008]步骤二、DYNLT5在人微血管内皮细胞中的内源性表达；
[0009]步骤三、慢病毒感染和敲减效率；
[0010]步骤四、细胞增殖实验；
[0011]步骤五、细胞周期实验；
[0012]步骤六、细胞凋亡实验；
[0013]步骤七、血管生成实验；
[0014]步骤八、为了探索DYNLT5在动脉粥样硬化斑块中的表达是否与同源盒2(MEOX2)、维生素D受体VDR相关，我们对来自GSE24495和GSE23304共222例人动脉粥样硬化斑块的基因表达谱进行基因回归分析。
[0015]优选的，所述步骤一中，以DYNLT5基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，构建目的基因RNA干扰慢病毒载体,对人微血管内皮细胞(HMEC)中的DYNLT5基因进行敲减表达，观察微血管内皮细胞的增殖和血管生成情况，完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体hU6
‑
MCS
‑
CMV
‑
EGFP；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证、质粒抽提，慢病毒包装。
[0016]优选的，所述步骤一中，重组子测序结果：
[0017]TTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCTTGATGATTCCACGGTATAACTCGAGTTATACCGTGGAATCATCAAGTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGTATTCATCCACCAATTAAGATCCATTAGGCGGGCGCGCGGATGACCGAATTACCGCCCTGCATGAATTATTAATAATAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGACAATATATGGAGGTCCGCGTTACATAACTTACGGAAAATGGACGGCCTGGCTGACCGACCAACGACCCACGCCCATTGACTGCCATAATGACTGATGTACGCATACATACTCCCATAAGGAGTTTCCATTGACTGCCATGAATGGATGAAGTACGGTAAA，其中AgeI酶切位点被破坏。
[0018]优选的，所述步骤二中，使用Real
‑
timequantitativePCR的方法检测DYNLT5在HMECmRNA的表达丰度，从定量PCR结果可以看出，基因DYNLT5在HMEC
‑
1细胞中的表达丰度为高。
[0019]优选的，所述步骤三中，使用含有DYNLT5RNA干扰序列的慢病毒感染HMEC，对照及目的慢病毒感染目的细胞后72小时于显微镜下荧光观察，观察结果显示细胞感染效率达到80％以上，细胞状态正常。
[0020]优选的，所述步骤三中，从定量PCR结果可以看出，经shRNA慢病毒感染后，实验组HMEC
‑
1细胞中DYNLT5基因在mRNA水平的表达量受到抑制(p<0.05)，敲减效率达到89.0％。
[0021]优选的，所述步骤四中，shRNA慢病毒感染HMEC
‑
1细胞，三天后，shDYNLT5组细胞增殖显著低于对照组(shCtrl)，增殖抑制明显。
[0022]优选的，所述步骤五中，shRNA慢病毒感染HMEC
‑
1细胞，培养5天后，shDYNLT5组相比对照组，shDYNLT5组处于S期、G1期的细胞增多(P<0.05)，处于G2/M期的细胞减少(P<0.05)。
[0023]优选的，所述步骤六中，shRNA慢病毒感染HMEC
‑
1细胞，培养5天后，相比对照组，shDYNLT5组凋亡数增多(P<0.05)。
[0024]优选的，所述步骤七中，相对shCtrl组，shDYNLT5组血管形成能力显著减弱，其中新生血管面积显著减少，新生血管长度显著减少，新生血管节点数显著减少，新生血管分枝数显著减少。
[0025]与现有技术相比，本专利技术提供了一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，具备以下有益效果：
[0026]本专利技术通过设置一系列实验，得出DYNLT5基因的新作用，DYNLT5基因具有促进血管生成、组织修复的作用。
[0027]该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本专利技术结构科学合理，使用安全方便，为人们提供了很大的帮助。
具体实施方式
[0028]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、DYNLT5RNA干扰慢病毒载体制备；步骤二、DYNLT5在人微血管内皮细胞中的内源性表达；步骤三、慢病毒感染和敲减效率；步骤四、细胞增殖实验；步骤五、细胞周期实验；步骤六、细胞凋亡实验；步骤七、血管生成实验；步骤八、为了探索DYNLT5在动脉粥样硬化斑块中的表达是否与同源盒2(MEOX2)、维生素D受体VDR相关，我们对来自GSE24495和GSE23304共222例人动脉粥样硬化斑块的基因表达谱进行基因回归分析。2.根据权利要求1所述的一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，其特征在于：所述步骤一中，以DYNLT5基因为模板，设计RNA干扰靶点序列，构建目的基因RNA干扰慢病毒载体,对人微血管内皮细胞(HMEC)中的DYNLT5基因进行敲减表达，观察微血管内皮细胞的增殖和血管生成情况，完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体hU6
‑
MCS
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CMV
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EGFP；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证、质粒抽提，慢病毒包装。3.根据权利要求2所述的一种DYNLT5基因在动脉粥样斑及组织修复中的应用，其特征在于：所述步骤一中，重组子测序结果：TTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCTTGATGATTCCACGGTATAACTCGAGTTATACCGTGGAATCATCAAGTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGTATTCATCCACCAATTAAGATCCATTAGGCGGGCGCGCGGATGACCGAATTACCGCCCTGCATGAATTATTAATAATAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGACAATATATGGAGGTCCGCGTTACATAACTTACGGAAAATGGACGGCCTGGCTGACCGACCAACGACCCACGCCCATTGACTGCCATAATGACTGATGTACGCATACATACTCCCATAAGGAGTTTCCATTGACTGCCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨敏，陈玲，刘涛，杨兴彪，古瑞，
申请(专利权)人：中国人民解放军西部战区总医院，
类型：发明
国别省市：