一株表达ASFVP30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，利用同源重组技术将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒基因组中的5

【技术实现步骤摘要】
一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，属于生物


技术介绍

[0002]日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis Virus，JEV)引起的一种以人中枢神经系统疾病与猪繁殖障碍性疾病为特征的人兽共患病。该病主要通过蚊子的叮咬进行传播，猪是JEV最重要的扩增宿主与储存宿主，猪感染JEV后会产生高滴度的病毒血症，当蚊子吸食猪的血液后，可将病毒进一步传播给人类或猪群。JEV感染妊娠的母猪后，可引发流产、产生死胎或木乃伊胎，感染公猪后则引起睾丸炎、单侧睾丸肿大而不育，这给我国养猪业的持续发展造成严重的危害。
[0003]目前，商品化的疫苗接种仍是作为预防和控制JEV感染的主要方法，包括传统的灭活病毒(P3毒株和HW1毒株)疫苗与减毒活病毒(SA14
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2毒株)疫苗。然而，这些疫苗的制苗用毒株均是来源于基因III型(GIII)，而目前我国乃至整个亚洲地区主要是以GI型JEV毒株流行为主，但当前尚无针对GI型毒株来源的疫苗。此外，现有的商品化疫苗对GI型毒株的保护效果并不理想，这使得GI型JEV具有更大的危害性。
[0004]非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病。非洲猪瘟病程短、发病急、感染性强，可以感染任何种类和年龄段的家猪和野猪，能使生猪的患病率和死亡率达到100％。自2018年8月我国首次在辽宁省沈阳市发现非洲猪瘟疫情后，疫情迅速蔓延至全国23个省份，对我国养猪业造成了极其严重的经济损失。目前国内还还尚无针对ASFV的疫苗，尽管一些国外的科学家已经对外公布非洲猪瘟疫苗研究生产成果，但其安全性与有效性仍值得进一步去评价。
[0005]ASFV的P30蛋白是一种很重要的结构蛋白，有很强的免疫原性，能诱导机体产生中和抗体。本研究利用反向遗传学技术，通过在GI型JEV 5
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UTR与C基因间引起ASFV的P30基因，获得表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒。该重组病毒在制备一种既能抗GI型JEV、又能抗ASFV的疫苗中具有广阔的应用价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。
[0007]本专利技术的目的是这样实现的：一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒的构建方法，其特征是：包括如下步骤：
[0008](1)、携带ASFV P30蛋白基因的GI型日本脑炎病毒全长cDNA感染性克隆的构建；
[0009]将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒的cDNA感染
性克隆质粒pOK
‑
rGI中，从而构建携带有ASFV P30蛋白基因的重组病毒基因组cDNA；具体步骤：
[0010]构建ASFV P30蛋白基因上游携带有日本脑炎病毒C基因前102个碱基序列以及下游含有T2A序列的基因组片段F2，基因组片段F2由人工合成，其序列为SEQ ID NO.2；
[0011]以质粒pOK
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rGI为模板利用两对引物F1
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F与F1
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R以及F3
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F与F3
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R，扩增出基因组片段F1与F3，F1与F3序列为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3；其中：
[0012]F1
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F引物为：GGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTT；
[0013]F1
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R引物为：CTGGTTTTTTAGTCATGGTTGTTCTTCCGTTCTAAAAAA；
[0014]F3
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F引物为：GAATCCCGGCCCTTCCGGGATGACCAAGAAGCCAGGAGGCCCG；
[0015]F3
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R引物为：CTTTCCCGAAAAGTCCACATCCATTTCCC；
[0016]利用限制性内切酶Not I和Sac II对感染性克隆载体pOK
‑
rGI进行酶切处理，回收酶切后的载体，相邻DNA片段间有20～30bp的同源序列，将基因片段F1，F2，F3与用Not I和Sac II酶处理的线性化感染性克隆载体pOK
‑
rGI进行等比例混合，并利用NEB Gibson Assembly重组酶进行同源重组；随后，转化大肠杆菌Top 10中，挑取单克隆菌落进行扩增与质粒提取，鉴定并测序正确的质粒命名为pOK
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rGI
‑
P30；
[0017](2)、重组病毒的拯救；
[0018]用限制性内切酶Sal I将质粒pOK
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rGI
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P30进行线性化处理后；利用T7体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit，以线性化质粒pOK
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rGI
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P30为模板，体外转录获重组病毒的基因组RNA全长；将重组病毒RNA利用转染试剂Lipofectamin MessengerMAX转染至BHK
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21细胞中，待出现典型细胞病变，获得拯救的rGI
‑
P30重组病毒。
[0019]步骤(1)中，所述的GI型日本脑炎病毒的cDNA感染性克隆质粒pOK
‑
rGI，序列如SEQ ID NO.4所示。
[0020]步骤(2)中，所述的rGI
‑
P30重组病毒，其基因组序列如SEQ ID NO.5所示。
[0021]利用所述的构建方法构建的一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒。
[0022]所述的构建方法构建的表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒在制备疫苗中的应用。
[0023]本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，本专利技术的目的在于提供通过上述构建方法得到的表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒。确定上述的重组病毒的遗传稳定性，携带P30蛋白基因的重组病毒能够稳定传代并表达ASFV的P30蛋白。还提供了表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒的应用。
[0024]本专利技术具有以下优点和效果：
[0025](1)本专利技术提供了一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒的感染性克隆构建方法，构建方法采用了同源重组的技术手段，方法高效快捷。从研发目的看，有了这个重组病毒的平台，可以人为地对病毒基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒的构建方法，其特征是：包括如下步骤：（1）、携带ASFV P30蛋白基因的GI型日本脑炎病毒全长cDNA感染性克隆的构建；将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒的cDNA感染性克隆质粒pOK
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rGI中，从而构建携带有ASFV P30蛋白基因的重组病毒基因组cDNA；具体步骤：构建ASFV P30蛋白基因上游携带有日本脑炎病毒C基因前102个碱基序列以及下游含有T2A序列的基因组片段F2，基因组片段F2由人工合成，其序列为SEQ ID NO.2；以质粒pOK
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rGI为模板利用两对引物F1
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F与F1
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R以及F3
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F与F3
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R，扩增出基因组片段F1与F3，F1与F3序列为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3；其中：F1
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F引物为：GGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTT；F1
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R引物为：CTGGTTTTTTAGTCATGGTTGTTCTTCCGTTCTAAAAAA；F3
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F引物为：GAATCCCGGCCCTTCCGGGATGACCAAGAAGCCAGGAGGCCCG；F3
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R引物为：CTTTCCCGAAAAGTCCACATCCATTTCCC；利用限制性内切酶Not I和Sac II对感染性克隆载体pOK
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rGI进行酶切处理，回收酶切后的载体；相邻DNA片段间有20～30bp的同源序列，将基因片段F1，F2，F3与用Not I和Sac II酶处理的线性化感染性克隆载体pOK
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【专利技术属性】
技术研发人员：李晨曦，李燕华，陈萱，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：