一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法，包括制备对照储备液、制备样品溶液、UPLC‑PDA检测和比对图谱。本发明专利技术利用UPLC法联合PDA法建立了一种能够同时分离、并测定兽药中22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物的检测方法。本发明专利技术方法既可以定性，也可以定量测定，通过与对照色谱图中的保留时间和光谱图中峰型的比较，可对其中的药物成分进行定性，在此基础上，通过外标法对药物成分进行定量检测。本发明专利技术提出的检测方法操作简便、快速、准确，适用范围宽、设备造价低廉、同时检出的目标化合物多，可以作为兽药制剂中非法添加物的检查方法，为规范兽药市场提供了技术保障，为兽药市场的监管提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽药检测的
，特别是涉及一种兽药中多种抗菌成分(尤其是非法添加的)同时检测的方法。
技术介绍
兽药是用于预防、治疗、诊断动物疾病或有目的地调节动物生理机能的物质(含药物饲料添加剂)，主要包括血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。由于市场经济的调节，市场上兽药品种较多，虽然国家出台了《兽药管理条例》，但很多企业为了追求利润，擅自改变兽药制剂组方、非法添加标准处方外的药物甚至违禁药物，这种造假行为极大地扰乱了兽药市场秩序，也成为农业部近年来重点打击查处的违法行为之一。磺胺类药物和喹诺酮类药物是兽药中常用的成分，具有吸收好、抗菌谱广等优点，但部分企业盲目追求兽药的疗效，不按照批准的处方生产兽药，而在批准的处方外额外添加其他的药物，磺胺类药物和喹诺酮类药物是经常被部分企业非法添加到多种兽药制剂中两类药物，这样做很容易造成用药安全性的不可控，因此这种行为是被禁止的。为了维持兽药市场的正常秩序，有关部门需要定期/不定期检查/抽查上市兽药的实际成分与其批准成分是否一致，是否有非法添加的物质。目前，针对兽药中是否非法添加上述两类药物的检测手段中，最常用的有普通高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。然而普通液相色谱法由于分离效率低、分析时间长等缺点，无法实现高通量、同时检测多种抗菌药物的目的。液相色谱-质谱联用法虽然可以做到高通量定性鉴别，但是质谱仪造价昂贵，且兽药制剂中非法抗菌药物的浓度较高，远超过质谱检测器的线性范围，也限制了该方法的推广应用。郑和辉.超高效液相色谱法检测化妆品中的12种磺胺抗生素[J].分析测试学报，2007,25(2):238-240.和陈静.超高效液相色谱法同时测定化妆品中的19种喹诺酮类抗生素[J].分析化学，2013,41(6):931-935.两篇文献中分别公开了用UPLC-PDA方法测定化妆品中的磺胺类药物或喹诺酮类药物，由于化妆品的剂型与兽药不同，样品的前处理方法也不一致，无法用来检测兽药中的磺胺类药物和喹诺酮类药物。另外，文献中两种方法分别对磺胺类药物或喹诺酮类药物进行检测，通常兽药中这两类药物都会添加，用文献的方法需要进行两次检测，检测效率低。不仅如此，文献中的两种方法对磺胺类药物的检测种类和数量都比较少(只能检测12种)，用于兽药的检测时，会造成漏检、结果不准确等问题，无法用于兽药中磺胺类药物和喹诺酮类药物的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种能够同时分离、并测定兽药中多种抗菌成分(22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物)的方法，包括以下步骤：步骤1)、制备对照储备液：分别将多种抗菌成分用溶剂A配制成浓度均为1mg/ml的对照储备液；步骤2)、制备样品溶液：称取兽药样品，用溶剂A配制成样品溶液；步骤3)、UPLC-PDA检测：分别将步骤1)得到的对照储备液和步骤2)得到的样品溶液注入超高效液相色谱仪(UPLC)，以PDA为检测器进行梯度洗脱程序，得到对照图谱和样品图谱(所述图谱包括色谱图和光谱图)；步骤4)、比对图谱：将步骤3)得到的样品图谱与对照图谱分别进行比对，得出兽药样品中添加的抗菌成分的种类和添加量。所述抗菌成分为磺胺类药物和/或喹诺酮类药物。所述磺胺类药物包括磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。所述喹诺酮类药物包括马波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星。所述步骤3)UPLC-PDA检测的色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL。所述步骤3)UPLC-PDA检测的流动相为：流动相A为0.05％-0.2％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液(pH＝3.35-3.45)，流动相B为乙腈。所述步骤3)UPLC-PDA检测的梯度洗脱程序分为八个阶段：阶段①：0-7min,9％-14％流动相B；阶段②：7-20min，14％-15.5％流动相B；阶段③：20-25min，15.5％-20％流动相B；阶段④：25-30min，20％-24％流动相B；阶段⑤：30-37min，24％-30％流动相B；阶段⑥：37-39min，30％-50％流动相B；阶段⑦：39-39.5min，50％-9％流动相B；阶段⑧：39.5-42min，9％-9％流动相B。所述步骤4)的比对图谱具体为：先比对样品色谱图与对照色谱图中是否有保留时间相同的峰；如果没有，说明样品中未添加对照图谱对应的抗菌成分，如果有，再进一步比对该保留时间相同的峰在样品光谱图和对照光谱图中的整体峰型、最大吸收波长是否一致，如果一致，则判断样品中含有对照图谱对应的抗菌成分，得到样品中添加的抗菌成分的种类，如果不一致，则判断样品中不含有对照图谱对应的抗菌成分；进一步计算样品色谱图中该峰的峰面积，得到该抗菌成分的添加量。所述溶剂A为乙腈与0.1％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液的混合液，其中，乙腈：0.1％甲酸水溶液的体积比为(40:60)-(70:30)。所述步骤2)制备样品溶液具体为：称取兽药样品，加入溶剂A，摇匀，超声3分钟以上，室温下0.22μm滤膜过滤，即得。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用UPLC法(超高效液相色谱法)联合PDA法(Photo-Diode Array，即光电二极管阵列检测器)建立了一种能够同时分离、并测定兽药中22种磺胺类药物和9种喹诺酮类药物的检测方法，主要对该方法中的流动相和梯度洗脱程序的参数(包括样品制备方法、色谱柱和检测器)进行了筛选和优化。本专利技术方法采用UPLC将兽药中的抗菌成分分离，进而对它们进行分别的鉴别测定。本专利技术方法既可以定性，也可以定量测定，通过与对照色谱图中的保留时间和光谱图中峰型的比较，可对其中的抗菌成分进行定性检测，在此基础上，通过外标法计算峰面积，对抗菌成分进行定量检测。本专利技术采用PDA检测器，利用全波段光谱图、纯度角和保留时间三项指标对色谱峰进行定性，解决了UV检测器仅依靠保留时间这一项指标，容易产生定性不准确的问题。同时，31种抗菌成分的最大吸收波长差异较大，采用PDA检测器也保证了各色谱峰均能得到最大吸光度值，提高了该检测方法的灵敏度。本专利技术提出的检测方法操作简便、快速、准确，适用范围宽、设备造价低廉、同时检出的目标化合物多，可以作为兽药制剂中非法添加物的检测方法，为规范兽药市场提供了技术保障，为兽药市场的监管提供了技术支持。此外，本专利技术方法还适用于水、土壤等对象中磺胺类化合物和喹诺酮类化合物的检测。附图说明图1所示为在280nm下按实施例4的色谱条件检测步骤3)的31种对照储备稀释液得到的色谱图；其中：1、磺胺脒，2、磺胺，3、苯磺酰胺，4、磺胺醋酰，5、磺胺嘧啶，6、甲氧苄啶，7、磺胺吡啶，8、马波沙星，9、磺胺甲基嘧啶，10、氧氟沙星，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)、制备对照储备液：分别将多种抗菌成分用溶剂A配制成浓度均为1mg/ml的对照储备液；步骤2)、制备样品溶液：称取兽药样品，用溶剂A配制成样品溶液；步骤3)、UPLC‑PDA检测：分别将步骤1)得到的对照储备液和步骤2)得到的样品溶液注入超高效液相色谱仪(UPLC)，以PDA为检测器进行梯度洗脱程序，得到对照图谱和样品图谱(所述图谱包括色谱图和光谱图)；步骤4)、比对图谱：将步骤3)得到的样品图谱与对照图谱分别进行比对，得出兽药样品中添加的抗菌成分的种类和添加量。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测兽药中多种抗菌成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)、制备对照储备液：分别将多种抗菌成分用溶剂A配制成浓度均为1mg/ml的对照储备液；步骤2)、制备样品溶液：称取兽药样品，用溶剂A配制成样品溶液；步骤3)、UPLC-PDA检测：分别将步骤1)得到的对照储备液和步骤2)得到的样品溶液注入超高效液相色谱仪(UPLC)，以PDA为检测器进行梯度洗脱程序，得到对照图谱和样品图谱(所述图谱包括色谱图和光谱图)；步骤4)、比对图谱：将步骤3)得到的样品图谱与对照图谱分别进行比对，得出兽药样品中添加的抗菌成分的种类和添加量。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗菌成分为磺胺类药物和/或喹诺酮类药物。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述磺胺类药物包括磺胺脒、磺胺、苯磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺硝苯。4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述喹诺酮类药物包括马波沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星。5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于，所述步骤3)UPLC-PDA检测的色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18 HD(2.1mm×150mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：1μL。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤3)UPLC-PDA检测的流动相为：流动相A为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓辉，万仁玲，杨秀玉，张广川，马秋冉，张璐，董玲玲，韩宁宁，杨星，赵富华，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11