一种樟芝萃取物制备及分析方法技术

本发明专利技术是提供一种樟芝萃取物优化的制备及分析方法。通过数学及统计学的实验设计，分析影响该萃取物的萃取率重要参数，并搭配核磁共振图谱定量法及高效液相层析串联质谱法，以量化及鉴定樟芝萃取物及其特定三萜类化合物。通过前述技术，可以分析/检测/量化药品、保健食品或其他商品中是否含有麦角甾烷及/或羊毛甾烷三萜类化合物及其总含量及各别含量。

【技术实现步骤摘要】

本案关于一种樟芝萃取物制备及分析方法，尤其，本案关于一种樟芝萃取物制备及分析的优化，以及该樟芝萃取物中麦角甾烷三萜类化合物及/或羊毛甾烷三萜类化合物的准确量化的分析方法。
技术介绍
樟芝(Androdia cinnamomea)又称樟菇、牛樟菇、牛樟芝等，为台湾特有的真菌菌种，生长于海拔400至2000公尺特有的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)树干腐朽的心材内壁，或枯死倒伏的牛樟木材阴暗潮湿的表面。因此，要寻找到野生的樟芝子实体或确认此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外观并不容易，也由于其生物活性成分具潜在的医药价值，因此樟芝的价格居高不下。由于樟芝子实体不易被发现及以人工方式培养，目前市面上多为樟芝菌丝体产品，其宣称具有抗癌、减少治疗引起的症状及其他副作用。此外，樟芝菌丝体产品也被发现具有抗氧化、抗过敏、免疫刺激效果。这些产品宣称具有与樟芝子实体相似的主要成分，包括具有细胞毒杀效果的三萜类、类固醇及具有免疫刺激性的多醣体等。传统上，樟芝被应用于健康食品，以避免发炎、过敏、皮肤癣、肝癌的发生，因此，樟芝菌丝体及子实体萃取物被认为是具有潜力的化学治疗药物，以对抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌细胞等，但各类有效成分的活性机制与抑制癌症能力并未被完整厘清及探讨。樟芝三萜类成分为其主要的二次代谢物，也是最受注目的活性成分。目前大部分用以评估樟芝三萜类量化标准分为两种方法，第一种是以重量也就是萃取率为依据，并以乙醇作为萃取溶剂，设定不同萃取时间作为调控参数，以获得的重量评估萃取率。但并无法分析所得的萃取物中总三萜类含量，以及麦角甾烷与羊毛甾烷三萜类各别含量。第二种则是分光光度测定法，根据樟芝三萜类特有的官能基团(羧基–COOH)与特定试剂在特定条件下反应所成的复合物颜色，以比色法完成樟芝总三萜类含量的测定。此外，大多数三萜类分子结构中含有双键，在光谱的紫外光波长区段有吸收峰，因此，可由紫外分光光度法于特定波长处测定吸收系数相近的总三萜类含量。例如，齐墩果酸(oleanolic acid)为三萜类有机酸，因为齐墩果酸和待测成分的化学结构相似，使用典型的三萜类成分显色剂(香草醛–冰醋酸–高氯酸(vanillin–glacial acetic acid–perchloric acid)与其反映显色，再以比色法测定其含量。其具体的显色原理主要是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双烯系统，并在酸作用下形成阳离子而显色，该方法为总三萜类成分的专属性显色方法。不过此方法易造成伪阳性，若待测样品中其他成分结构带有羧基也会与特定显色剂反应而发生误判。上述两种方法为常用于检测樟芝总三萜类的方法，但其准确性不佳，要作为量化标准仍有改善空间。此外，中国台湾专利公开号TW 201416673 A揭露了牛樟芝三萜类成分的定量方法，其是以层析方法取得牛樟芝指纹图谱，再计算指定区间吸收峰与外部标准品的积分面积比值，进一步计算三萜类含量，但该专利技术公开案并未揭露样品萃取方法以及样品中包含麦角甾烷及羊毛甾烷三萜类的总含量及各别含量。此外，中国台湾专利号I407100揭露了利用高效液相层析分析牛樟芝三萜类的方法，但未揭露樟芝子实体所含有的三萜类的量化方法。本案申请人鉴于现有技术中的不足，经过悉心试验与研究，并本着锲而不舍的精神，终构思出本案“一种樟芝萃取物制备及分析方法”，能够克服现有技术的不足，以下为本案的简要说明。
技术实现思路
为了克服现有技术无法有效量化樟芝萃取物的萃取率及其所含特定三萜类化合物，以及建立樟芝萃取最佳工艺以更能确保及管控其所含总三萜类的含量，本专利技术对樟芝源头的萃取工艺进行分析，开发三萜类成分准确的量化标准来确保及管控樟芝来源的质量。本专利技术通过数学及统计学的实验设计，分析影响该萃取物的萃取率重要参数，并搭配核磁共振图谱定量法及高效液相层析串联质谱法，以量化及鉴定樟芝萃取物及其特定三萜类化合物。通过前述技术，可以分析/检测/量化药品、保健食品或其他商品中是否含有麦角甾烷及/或羊毛甾烷三萜类化合物及其总含量及各别含量。本文用语“樟芝萃取物”是指萃取自樟芝子实体、菌丝体或前二者的组合的萃取物，意即樟芝子实体萃取物、樟芝子实体萃取物或樟芝子实体/菌丝体萃取物。较佳地，本文内容是以醇类萃取樟芝子实体、菌丝体或前二者的组合所获得的萃取物。本文所揭示的醇类较佳地为甲醇、乙醇或前二者的组合。较佳地，本文所揭示的醇类、甲醇及/或乙醇的浓度为醇类、甲醇及/或乙醇与水调和后的浓度。本文的“樟芝”及“樟芝萃取物”含有麦角甾烷三萜类及/或羊毛甾烷三萜类，其合称为三萜类。各种麦角甾烷三萜类及各种羊毛甾烷三萜类分别总称为总麦角甾烷三萜类及总羊毛甾烷三萜类。总麦角甾烷三萜类及总羊毛甾烷三萜类的总称为总三萜类。此外，实际上含有或者宣称含有前述麦角甾烷三萜类及羊毛甾烷三萜类的单方药物、复方药物、处方药物、非处方药物、健康食品、饮品、嗜好品或诸如此类均落入本案“樟芝萃取物”的定义。本专利技术提供一种药物组合物，其包括如后文所揭示的有效剂量的麦角甾烷三萜类(式I～式X)及羊毛甾烷三萜类(式XI～式XIV)的组合物的其中之一。麦角甾烷三萜类组合物包括于后文所揭示的antcin K(式I、式II)、antcin C(式III、式IV)、樟芝酸C(式V、式VI)、樟芝酸B(式VII)、樟芝酸A(式VIII、式IX)及/或antcin A(式X)的组合物(或称为立体异构纯化合物)；而羊毛甾烷三萜类组合物包括去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid，式XI)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid，式XII)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid，式XIII)及/或层孔菌酸(eburicoic acid，式XIV)。本专利技术提供一种检测樟芝中至少一麦角甾烷三萜类组合物的含量的方法，包括下列步骤：以醇类萃取樟芝子实体及/或菌丝体，获得樟芝萃取物，以1H核磁共振图谱仪检测樟芝萃取物，确定樟芝萃取物中是否具有至少一麦角甾烷三萜类组合物。进一步而言，前述检测步骤还包括以1H核磁共振图谱仪检测该至少一麦角甾烷三萜类组合物的第28位置亚甲基信号。再者，该检测方法还用以同时检测樟芝中至少一羊毛甾烷三萜类组合物的含量，包括步骤：以1H核磁共振图谱仪检测樟芝萃取物，确定樟芝萃取物中是否具有至少一羊毛甾烷三萜类组合物。再以1H核磁共振图谱仪检测该至少一羊毛甾烷三萜类组合物的第28位置亚甲基信号。本专利技术另提出一种检测一待测萃取物中的麦角甾烷三萜类组合物的总含量的方法，包括下列步骤：以特定麦角甾烷三萜类化合物为标准品，配制为不同浓度并制作该标准品的核磁共振图谱及检量线；以核磁共振图谱仪分析待测萃取物中的麦角甾烷三萜类组合物的第28位置亚甲基信号；以及对比检量线及第28位置亚甲基信号，由第28位置亚甲基信号的积分面积比，计算待测萃取物中的麦角甾烷三萜类组合物的总含量。参照前述检测方法，本专利技术另提出一种检测待测萃取物中的羊毛甾烷三萜类组合物的总含量的方法，包括下列步骤：以特定羊毛甾烷三萜类化合物为标准品，配制为不同浓度并制作该标准品的核磁共振图谱及检量线；以核磁共本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种樟芝的萃取方法，包括步骤：(a)选择第一参数、第二参数及第三参数，其中该第一、该第二及该第三参数各具有极大值、极小值以及介于该极大值与该极小值之间的数值，并将各该极小值、该数值及该极大值分别给定域值‑1、域值0及域值1；(b)以该域值‑1、该域值0及该域值1组合出多个萃取条件来萃取少量的樟芝，获得多个樟芝萃取物；(c)使用式I方程式评估各该多个樟芝萃取物的萃取反应值：其中y为该萃取反应值，A(0,1,2...)为常数，x(1,2,3)为该第一、该第二及该第三参数；(d)对该多个樟芝萃取物进行核磁共振图谱分析，获得各该多个樟芝萃取物中总麦角甾烷三萜类与总羊毛甾烷三萜类的特征信号的积分面积值；以及(e)依据该萃取反应值、该积分面积值及使用者的需要，使用该第一、该第二及该第三参数的该极大值、该极小值、介于该极大值与该极小值之间的该数值以及介于该极大值与该极小值之间的任一数值的其中之一对大量的樟芝进行萃取，以获得樟芝萃取物。

【技术特征摘要】
2015.04.30 TW 1041139951.一种樟芝的萃取方法，包括步骤：(a)选择第一参数、第二参数及第三参数，其中该第一、该第二及该第三参数各具有极大值、极小值以及介于该极大值与该极小值之间的数值，并将各该极小值、该数值及该极大值分别给定域值-1、域值0及域值1；(b)以该域值-1、该域值0及该域值1组合出多个萃取条件来萃取少量的樟芝，获得多个樟芝萃取物；(c)使用式I方程式评估各该多个樟芝萃取物的萃取反应值：其中y为该萃取反应值，A(0,1,2...)为常数，x(1,2,3)为该第一、该第二及该第三参数；(d)对该多个樟芝萃取物进行核磁共振图谱分析，获得各该多个樟芝萃取物中总麦角甾烷三萜类与总羊毛甾烷三萜类的特征信号的积分面积值；以及(e)依据该萃取反应值、该积分面积值及使用者的需要，使用该第一、该第二及该第三参数的该极大值、该极小值、介于该极大值与该极小值之间的该数值以及介于该极大值与该极小值之间的任一数值的其中之一对大量的樟芝进行萃取，以获得樟芝萃取物。2.如权利要求1所述的萃取方法，其中该樟芝为樟芝子实体、樟芝菌丝体或其组合，且该第一参数、第二参数及第三参数分别为温度、时间及醇类浓度。3.如权利要求2所述的萃取方法，其中该温度的极大值、极小值以及介于该极大值与该极小值之间的数值分别为75℃、25℃及50℃。4.如权利要求2所述的萃取方法，其中该时间的极大值、极小值以及介于该极大值与该极小值之间的数值分别为90分钟、30分钟及60分钟。5.如权利要求2所述的萃取方法，其中该醇类浓度为醇类与水调制的浓度，且该醇类为甲醇及乙醇的其中之一。6.如权利要求5所述的萃取方法，其中当该醇类为该乙醇时，该乙醇与水调制为乙醇浓度，该乙醇浓度的极大值、极小值以及介于该极大值与该极小值之间的数值分别为95％、35％及65％。7.如权利要求1所述的萃取方法，其中在54.6℃的该温度、58...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴永昌，吕美津，吴东颖，杜英齐，
申请(专利权)人：吴永昌，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71