本发明专利技术涉及一种高灵敏高选择性检测MC-LR的核酸适配体光电化学传感器的制备方法。该传感器采用阳极氧化法在钛基底上制备二氧化钛纳米管，并修饰硫化镉纳米粒子，以壳聚糖和戊二醛对电极表面进行功能化组装构筑光电生物界面。将具有特定碱基序列的MC-LR的核酸适配体化学键合至基体电极表面，制备得到MC-LR核酸适配体光电化学传感器。本发明专利技术将超灵敏的光电分析技术与对MC-LR具有特异性识别能力的核酸适配体技术相结合，成功实现对MC-LR的高灵敏度和高选择性分析检测，MC-LR检测限低达5.3×10-12mol/L，线性检测范围为7.2×10-8~8×10-12mol/L。与现有技术相比，该传感器具有制备简单、响应迅速、成本低廉的优点，可同时实现对MC-LR的高灵敏度和高选择性分析的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光电化学分析技术和环境检测
，涉及一种高灵敏高选择性检测MC-LR的核酸适配体光电化学传感器的制备方法。
技术介绍
微囊藻毒素-LR (MC-LR)是由蓝藻菌在富含N、P元素的富营养化水体内繁殖过程中释放的一种环状七肽类水体环境污染物。由于分子内环状结构与间隔双键的存在，MC-LR化学性质稳定，在自然条件下难以降解；MC-LR毒性强，极低浓度的MC-LR即能抑制蛋白质磷酸酯酶PPl和PP2A的活性，引起肝细胞分解、破裂，导致肝细胞功能障碍，对人与动物均表现出强烈的肝毒性及肿瘤促进作用。近年来巢湖、太湖等淡水湖蓝藻频频爆发，对居民的生活饮用水造成严重污染，因此实现对MC-LR的快速、高灵敏度与高选择性检测具有重要的现实意义。目前，测定MC-LR的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、质谱法以及液质联用(LC-MS)法，上述方法虽然具有较高的灵敏度和准确性，但是存在样品前处理复杂、仪器价格高昂、分析耗时等缺点。与HPLC，LC-MS等相比，电化学分析方法具有灵敏度高、仪器价格低廉、信号响应迅速、易于在线检测等优点。例如，Campas等人将特异性识别MC-LR的抗体吸附在丝网印刷石墨烯电极基底上制备的电化学免疫传感器，可实现对MC-LR的分析检测。但是，MC-LR是一种电化学惰性的物质，无法实现直接的电化学传感检测。光电化学分析方法是在电化学分析方法基础上发展起来的一种新型的分析方法，除了具有电化学分析方法的优点以外，由于引入光作为激发能量，表现出了更高的灵敏度。但是，光电化学分析过程中的活性氧物种主要为具有强氧化能力的.ΟΗ，对不同分子结构无差异化氧化，从而导致实现选择性的分析非常困难。因此需要对电极表面进行功能化，将具有识别功能的分子修饰到电极表面，赋予光电传感器的选择性。核酸适配体(aptamer)是一种采用SELEX技术体外筛选、合成的单链DNA或者RNA序列，对靶物质具有出高度专一的结合能力。同时，核酸适配体具有合成周期短、合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点。因此，本专利技术中将超灵敏的光电分析技术与具备特异性识别功能的MC-LR核酸适配体结合，构筑光电化学适配体传感器，以实现对MC-LR的高灵敏度和高选择性分析检测。在本专利技术中，首先采用阳极氧化法在钛基底上制备二氧化钛纳米管，采用电化学沉积法将硫化镉纳米粒子均匀沉积在二氧化钛纳米管内外，制备得到硫化镉纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管电极(CdS NPs-T12 NTs)，以壳聚糖和戊二醛对电极表面进行功能化组装构筑兼备高光电活性与优良生物兼容性的光电传感界面，将适配体分子化学键合至光电传感界面上，制备得到了一个新颖的MC-LR核酸适配体光电化学传感器。该传感器具有制备简单、响应迅速、灵敏度高且选择性专一的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对MC-LR的现有分析技术的仪器价格高昂、分析耗时、难以实现选择性分析缺陷而提供的一种基于高灵敏高选择性检测MC-LR的核酸适配体光电化学传感器的制备方法。通过将具备特异性识别MC-LR的核酸适配体键合至修饰电极表面，提高了分析方法的选择性，并且该检测方法在分析MC-LR时表现出超高的灵敏度。本专利技术提出的一种高灵敏高选择性检测MC-LR的核酸适配体光电化学传感器的制备方法，具体步骤如下: (1)钛板依次经过不同目数的砂纸进行机械打磨至表面呈平滑的镜面，随后依次置于去离子水、乙醇和去离子水中分别超声清洗10~20分钟，取出钛板用30~60%的HCl刻蚀10-20分钟；将完成刻蚀的钛板作为阳极，铂片作为阴极，控制两电极间距为I cm，以含有0.1-0.3 wt%氟化钱和1~5 vol%水的乙二醇溶液为电解液，20~30°C恒温下，外加槽电压为20-40 V阳极化2 ~3小时，待阳极化完成后，取出电极用去离子水分两次超声清洗，每次清洗时间为I分钟，干燥后得到T12 NTs ； (2)以T12NTs为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，50~70°C恒温条件下，于 10~30mL 含有 0.1-0.5 mol/L 的 CdCl2^P 0.01-0.1 mol/L 的 Na2S2Oj^混合液中，-0.3~-0.7 V电压下沉积800~1000 s ;待电沉积完成后用去离子水清洗电极并自然晾干；将晾干后的经过沉积的T12 NTs电极置于管式炉中，于氮气气氛下500°C烧结300~400分钟晶化，升温及降温的速率均为1~5°C /分钟，制备得到硫化镉纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管电极(CdS NPs-T12 NTs);用AB胶对制备的二氧化钛纳米管电极进行封和，留有Icm X I cm的电极面积； (3)取CdS NPs-T12 NTs 电极，旋涂滴加 10.0-40.0yL 浓度为 0.5-2.5% w/v 壳聚糖溶液，40~60°C下干燥5~10分钟，CdS NPs-T12 NTs电极干燥后依次用0.1 mol/L的NaOH、高纯水润洗并干燥后置于1%~10%的戊二醛溶液中继续反应20~40分钟；CdS NPs-T12 NTs电极取出后，向CdS NPs-T12 NTs电极表面滴加10~40 μ L浓度为2.0 X I(T6 mol/L的MC-LR适配体溶液，于4°C下培育12~18 h。用高纯水冲洗掉物理吸附的适配体后，用1~10UL浓度为1~3% w/v BSA对CdS NPs-T12 NTs电极上剩余的醛基位点进行封端，由此制备得到核酸适配体光电化学传感器；其中，使用的MC-LR适配体的碱基序列为:5， -h2n-ggcgc-caaac-aggac-cacca-tgaca-ATTAC-CCATA-CCACC-TCATT-ATGCC-CCATC-TCCGC-3’。本专利技术提出的核酸适配体光电化学传感器应用于检测MC-LR，检测方法具体步骤如下: 以制备的核酸适配体光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，以含有0.1 mol/L的抗坏血酸的PBS缓冲液为电解液；配置一系列不同浓度的MC-LR标准溶液，依照标准加入法向溶液中滴加并于室温下作用10~40分钟；可见光照射下，施加0.0 V偏压，采用i~t曲线法测定含有不同浓度MC-LR的电解液的光电流，利用光电流的差值Δ I与MC-LR浓度的对数之间的线性关系建立工作曲线。本专利技术提出的核酸适配体光电化学传感器应用于选择性检测MC-LR，具体步骤如下: 以制备的核酸适配体光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，以MC-LR的标准溶液和100倍于MC-LR浓度的干扰物质混合液加入到电解池中作为电解液；配置一系列不同浓度的MC-LR标准溶液，依照标准加入法向溶液中滴加并于室温下作用10~40分钟；可见光照射下，施加0.0 V偏压，采用i~t曲线法测定含有不同浓度MC-LR的电解液的光电流，利用光电流的差值Δ I与MC-LR浓度的对数之间的线性关系建立工作曲线。本专利技术中，所述干扰物质包括阿特拉津、四螨嗪、啶虫脒、敌百虫、杀虫单、百草枯、草甘膦或氧乐果中任一种。本专利技术提出的核酸适配体光电化学传感器应用于实际水样中MC-LR的检测，具体步骤如下: 以制备的核酸适配体光电化学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高灵敏高选择性检测MC‑LR的核酸适配体光电化学传感器的制备方法，其特征在于具体步骤如下：（1）钛板依次经过不同目数的砂纸进行机械打磨至表面呈平滑的镜面，随后依次置于去离子水、乙醇和去离子水中分别超声清洗10~20分钟，取出钛板用30~60%的HCl刻蚀10~20分钟；将完成刻蚀的钛板作为阳极，铂片作为阴极，控制两电极间距为1 cm，以含有0.1~0.3 wt%氟化铵和1~5 vol%水的乙二醇溶液为电解液，20~30℃恒温下，外加槽电压为20~40 V阳极化2 ~3小时，待阳极化完成后，取出电极用去离子水分两次超声清洗，每次清洗时间为1 分钟，干燥后得到TiO2 NTs；（2）以TiO2 NTs为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，50~70℃恒温条件下，于10~30mL含有0.1~0.5 mol/L的CdCl2和0.01~0.1 mol/L的Na2S2O3的混合液中， ‑0.3~‑0.7 V电压下沉积800~1000 s；待电沉积完成后用去离子水清洗电极并自然晾干；将晾干后的经过沉积的TiO2 NTs电极置于管式炉中，于氮气气氛下500℃烧结300~400分钟晶化，升温及降温的速率均为1~5℃/分钟，制备得到硫化镉纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管电极（CdS NPs‑TiO2 NTs）；用AB胶对制备的二氧化钛纳米管电极进行封和，留有1 cm×1 cm的电极面积；（3）取CdS NPs‑TiO2 NTs电极，旋涂滴加10.0~40.0 μL 浓度为0.5~2.5% w/v壳聚糖溶液，40~60℃下干燥5~10分钟，CdS NPs‑TiO2 NTs电极干燥后依次用0.1 mol/L的NaOH、高纯水润洗并干燥后置于1%~10%的戊二醛溶液中继续反应20~40分钟；CdS NPs‑TiO2 NTs电极取出后，向CdS NPs‑TiO2 NTs电极表面滴加10~40 μL 浓度为 2.0 ×10‑6 mol/L 的MC‑LR适配体溶液，于4℃下培育12~18 h；用高纯水冲洗掉物理吸附的适配体后，用1~10 μL 浓度为1~3% w/v BSA对CdS NPs‑TiO2 NTs电极上剩余的醛基位点进行封端，由此制备得到核酸适配体光电化学传感器；其中，使用的MC‑LR适配体的碱基序列为：5’‑H2N‑GGCGC‑CAAAC‑AGGAC‑CACCA‑TGACA‑ATTAC‑CCATA‑CCACC‑TCATT‑ATGCC‑CCATC‑TCCGC‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵国华，李修艳，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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