本发明专利技术公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明专利技术具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明专利技术可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于RT-PCR检测
，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温 式RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
鸭肝炎是鸭肝炎病毒（DHV)引起的一种传播迅速并对雏鸭具有高度致死性的病 毒病，以肝脏肿大及出血为主要发病症状。DHV根据血清型曾被分为I型DHV (DHV-1)、II 型DHV (DHV-2)和III型DHV (DHV-3)，但后来又发现，血清I型鸭肝炎病毒还存在两个变种， 分别是"台湾NDHV"变异株和"韩国NDHV"变异株，且这两个变异株均不与血清I型DHV产 生交叉中和反应。最新分类将血清I型DHV及其变异株重新更名为鸭甲肝病毒（DHAV)， 而原来的血清II型和III型DHV则被更名为鸭星状病毒1型（DAstV-I)和鸭星状病毒2型 (DAstV-2)，归属为星状病毒科。传统的血清I型DHV和"台湾NDHV"、"韩国NDHV"则被分 类为 DHAV-1、DHAV-2 和 DHAV-3。 目前，我国流行的DHAV主要为DHAV-I和DHAV-3,由于DHAV-I和DHAV-3所导致的 鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化非常相似，常常不能正确诊断和有效防控而给养殖业造 成巨大经济损失。虽然对DHAV-I和DHAV-3传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、 琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限 性，更不能有效鉴别是何种DHAV所造成的感染。 PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反 应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣 势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。二温式PCR是根 据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，把退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR退 火温度高，不仅提高了反应的特异性，更大大缩短了检测时间。然而，建立二重PCR方法比 单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒 1型和3型两种病原体。 为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型和3型二重二温 式RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4,它们分别具有 序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4的碱基序列。 引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1 : 0.5-1 : 1 : 1。 引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为I : I : 1 : 1。 上述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的非 诊断应用，PCR扩增的退火温度为60. 0-70. (TC。 PCR扩增的退火温度为65°C。 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂： A液：PCR反应液，含2XTaq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、DHAV-1上下游引 物、0祖￥-3上下游引物、(1(1!120,0祖￥-1上下游引物分别是引物1和2,0祖￥-3上下游引物分 别是引物3和4,引物1至4分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 4的碱基序列； B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照； C液：ddH20,作为阴性对照。 PCR 反应液含 2XTaq PCR Mix 12. 5 μ L、DHAV-I 上下游引物各 0· 5 μ 1、 DHAV-3上下游引物各0. 5 μ 1、CldH2O 7. 5 μ L，其中各引物浓度均为25 μ mol/mL ;Β液含 DHAV-1+DHAV-3 模板共 3 μ L，C 液为 2 μ L ddH20。 上述鸭甲肝病毒I型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的非 诊断应用，PCR扩增的退火温度为60. 0-70. (TC。 PCR扩增的退火温度为65°C。 针对目前缺乏对鸭甲肝病毒1型和3型同时进行检测和诊断的有效可靠的技术， 专利技术人研宄设计了两对特异性引物，据此建立了鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR 检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本专利技术具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复 性好等优点，应用本专利技术可同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约 时间的成本，又可以减少污染。【附图说明】 图1是二重PCR敏感性试验结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder， I. DHAV-lcDNA+DHAV-3cDNA (等体积混合），2. DHAV-lcDNA，3. DHAV-3cDNA，4. H5AIV 的 cDNA， 5. H9AIV的cDNA，6.番鸭呼肠孤病毒的cDNA，7.番鸭细小病毒的DNA，8.鸭圆环病毒DNA， 9.鸭副粘病毒的cDNA，10.鸭瘟病毒的DNA，11.阴性对照（CldH2O)。 图2是二重PCR特异性试验结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder，1.49ng DHAV-lcDNA 和 75ng DHAV-3cDNA，2.4.9ng DHAV-lcDNA 和 7.5ng DHAV-3cDNA，3.490pg DHAV-lcDNA 和 750pg DHAV-3cDNA，4.49pg DHAV-lcDNA 和 75pg DHAV-3cDNA，5.4.9pg DHAV-lcDNA 和 7. 5pg DHAV-3cDNA，6. 0· 49pg DHAV-lcDNA 和 0· 75pg DHAV-3cDNA。 图3是二重PCR部分临床样品检测结果电泳图，图中：M. IOObp DNA ladder，I阳 性对照（DHAV-lcDNA+DHAV-3CDNA)，2-17分别为部分有目的条带的鸭病料检测结果。【具体实施方式】 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下： 鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所。 鸭肝炎病毒（DHAV-I)记载在"鸭I型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立"， 中国预防兽医学报，2012,34(2): 112-115,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 鸭肝炎病毒（DHAV-3)记载在"新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定"，广西畜牧兽 医，2003,19 (5) : 198-199,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 番鸭细小病毒记载在"广西番鸭细小病毒的分离和鉴定"，广西畜牧兽医，2002， 18 (6) : 5-7,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 鸭圆环病毒记载在"广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查"，中国畜牧兽医， 2010, 37 (11) : 156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研宄所获得。 鸭副粘病毒（鸭新城疫）记载在"鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法 的建立"，中国动物检疫，2012, 本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，赵虹，谢丽基，刘加波，罗思思，谢志勤，邓显文，黄莉，黄娇玲，曾婷婷，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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