本发明专利技术属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及用于以RT‑LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒(香蕉束顶病毒、香蕉线条病毒及黄瓜花叶病毒)的引物及其检测方法。所述引物包括BBTV引物组SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7、BSV引物组SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:14和CMV引物组SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:21中的至少一种。本发明专利技术还提供了一种利用上述引物以RT‑LAMP法快速检测香蕉重要病毒的检测方法。本发明专利技术直接以香蕉叶片RNA为模板同时检测香蕉DNA病毒和RNA病毒，采用RT‑LAMP反应，一步实现cDNA合成和LAMP反应，反应仅需1h。
【技术实现步骤摘要】
用于以RT-LAMP法快速检测香蕉病毒的引物及方法
本专利技术属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及用于以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒(香蕉束顶病毒、香蕉线条病毒及黄瓜花叶病毒)的引物及其检测方法。
技术介绍
香蕉是重要的粮食作物、经济作物，在超过130个国家均有种植，并为亚洲、非洲、美洲、大洋洲等的数以百万计的农民提供主要粮食以及经济收入。在2012年，香蕉的总产量达到1.39亿吨以上，种植面积达1030万公顷；香蕉已经成为次于玉米、水稻、小麦、马铃薯以及木薯的第六大粮食作物(来源于FAO2014年统计数据)。香蕉的种植、收获在全年中不受季节限制，且主要依靠从母株分离吸芽进行繁殖。然而，该种植方式具有明显的缺点，香蕉植株会在不同的生长发育阶段受到各种不利环境因素的影响，如害虫、病原菌等，并导致世界范围内的香蕉病虫害的频繁发生。其中，香蕉病毒病是影响香蕉正常生长的重要制约因素。香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus，BBTV)、香蕉线条病毒(Bananastreakvirus，BSV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV))是香蕉病毒中的三种重要病毒；这三种病毒严重影响了香蕉的产量和品质，并制约了香蕉产业的进出口贸易。BBTV、BSV以及CMV分别属于矮缩病毒属(Nanavirus)，杆状病毒属(Badnavirus)以及黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)。然而，由于缺乏抗病品种等有效的病毒病防治方法，有效的防治香蕉病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的基本工具则是灵敏、准确、快速的检测方法。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)能在等温(60～65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增的方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于PCR技术。LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60分钟内实现109～1010倍的扩增，使得LAMP同时具备高特异性、高灵敏度以及快速等优点。已有的香蕉病毒的LAMP研究均是单项的，且是分别以DNA和RNA为模板，不适合香蕉组培种苗的快速检测或者田间香蕉植株的快速检测，检测过程较为耗时、耗工和耗钱，容易错过农时，不符合生产实际要求。因此，建立一套以RT-LAMP为基础的多种香蕉病毒的稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法具有应用前景。本专利技术检测方法直接以香蕉叶片RNA为反应模板，不需分别提取DNA和RNA，减少实验环节，且开发的RT-LAMP检测技术不仅特异、灵敏，而且反应时间短，可在1h内完成检测反应；使用本专利技术检测方法对香蕉种苗及种植区的植株进行检疫检测，可有效防止香蕉病毒病的扩散与蔓延，确保香蕉的安全生产。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供用于以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒(香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus，BBTV)、香蕉线条病毒(Bananastreakvirus，BSV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV))的引物。本专利技术分别根据BBTV的Coatprotein、BSV的RNaseH以及CMV的Coatprotein的保守基因组序列设计LAMP检测引物，可特异检测各个香蕉病毒。本专利技术另一目的在于提供一种采用上述引物以RT-LAMP法快速检测香蕉三种重要病毒的检测方法。本专利技术再一目的在于提供上述检测方法的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现：用于以RT-LAMP法快速检测香蕉重要病毒(香蕉束顶病毒(BBTV)、香蕉线条病毒(BSV)以及黄瓜花叶病毒(CMV))的引物，包括BBTV引物组、BSV引物组和CMV引物组中的至少一种，其中，BBTV引物组包括外引物对BBTV-F3和BBTV-B3，内引物对BBTV-FIP和BBTV-BIP，以及环引物对BBTV-LF和BBTV-LB；BSV引物组包括外引物对BSV-F3和BSV-B3，内引物对BSV-FIP和BSV-BIP，以及环引物对BSV-LF和BSV-LB；CMV引物组包括外引物对CMV-F3和CMV-B3，内引物对CMV-FIP和CMV-BIP，以及环引物对CMV-LF和CMV-LB，见表1所示：表1香蕉三种病毒BBTV、BSV以及CMVRT-LAMP检测特异引物本专利技术还提供了一种利用上述引物以RT-LAMP法快速检测香蕉重要病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)对样本进行处理，抽提样本RNA；(2)直接以样本RNA为模板，利用上述引物以实时荧光RT-LAMP法进行检测。所述的样本处理优选抽提香蕉叶片RNA作为样本RNA。所述样本RNA优选在检测前进行DNase处理。从而去除样本中DNA的假阳性影响。所述DNase处理反应体系及反应程序优选如下:RNA2μL(100ng)，10×ReactionBuffer1μL，RQ1RNase-FreeDNase(无RNA酶的DNA酶)1U/μgRNA，加6μLNuclease-freewater(无核酸酶水)至终体积10μL，37℃反应30min；加入1μLRQ1DNaseStopSolution终止反应，65℃反应10min。所述RNA的抽提方法，优选用植物RNA提取试剂盒进行抽提。当选取其中一种引物组进行上述检测时，RT-LAMP检测体系优选为：2.5μL10×ThermoPolReactionBuffer(Mg2+free)，10mMMgSO4，1.2mMdNTPmix，0.2μMLAMP-F3/B3，1.6μMLAMP-FIP/BIP，0.8μMLAMP-LF/LB，1Mbetaine(甜菜碱)，8UBacillusstearothermophilusDNApolymerase(嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶)，450nMEvaGreen，40UM-MLVreversetranscriptase，RNA模板1μL，加8.95μLddH2O至终体积25μL。当选取上述一种以上引物组同时进行上述检测时，RT-LAMP检测体系优选为：2.5μL10×ThermoPolReactionBuffer(Mg2+free)，10mMMgSO4，1.2mMdNTPmix，每种引物组中各引物对浓度分别是0.1μMLAMP-F3/B3，0.8μMLAMP-FIP/BIP，0.4μMLAMP-LF/LB，1Mbetaine，8UBacillusstearothermophilusDNApolymerase，450nMEvaGreen，40UM-MLVreversetranscriptase，RNA模板1μL，加7.85μLddH2O至终体积25μL。所述的检测优选在荧光定量PCR仪上进行。所述的检测时反应条件优选为65℃1min，60个循环，在65℃时每循环采集荧光信号(FAM)；85℃2min。本专利技术所述的检测方法反应时间仅本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于以RT‑LAMP法快速检测香蕉重要病毒的引物，其特征在于：包括BBTV引物组、BSV引物组和CMV引物组中的至少一种，其中，BBTV引物组包括外引物对BBTV‑F3和BBTV‑B3，内引物对BBTV‑FIP和BBTV‑BIP，以及环引物对BBTV‑LF和BBTV‑LB；BSV引物组包括外引物对BSV‑F3和BSV‑B3，内引物对BSV‑FIP和BSV‑BIP，以及环引物对BSV‑LF和BSV‑LB；CMV引物组包括外引物对CMV‑F3和CMV‑B3，内引物对CMV‑FIP和CMV‑BIP，以及环引物对CMV‑LF和CMV‑LB，序列如下所示：BBTV‑F3：5'‑CTA CTG ATA AAA CAT TAC CCA GAT‑3'；BBTV‑B3：5'‑TCC CCA CTA CAT ACC AGT T‑3'；BBTV‑FIP：5'‑CTC TTG ATC ATA GCC CAA TGA AGT ATG GAA AAT GTT TAT GCT TCT TGT‑3'；BBTV‑BIP：5'‑TCT TGG GAA ATC AAC CAG CCG TAA CCA GAT GGC TAT GTT CAG‑3'；BBTV‑LF：5'‑CGG GCT TCA CCT TGC AC‑3'；BBTV‑LB：5'‑TCT GGA AGC CCC AGG TTT AT‑3'；BSV‑F3：5'‑ATG CTA GGA GCT ACA TTC C‑3'；BSV‑B3：5'‑TCC ACT TAC ATA CCC CTC C‑3'；BSV‑FIP：5'‑CCA GTC CTG AGT ATT CAT TCT TCT TGA AAC TGG GAA AAA TCC TTG G‑3'；BSV‑BIP：5'‑GAA GTT GTA GCT AAT CTG CCA GAA TCC ATA CAG CCA TCC GTT‑3'；BSV‑LF：5'‑GGA CTC GTT TTG GCA TAC AGT G‑3'；BSV‑LB：5'‑CTT GAG TTA CCC CCC GAA AAA GC‑3'；CMV‑F3：5'‑CGT AAA GTT CCT GCC TCC TC‑3'；CMV‑B3：5'‑GGT GCT CGA TGT CAA CAT GA‑3'；CMVI‑FIP：5'‑GGC TTG AAC TCC AGA TGC AGC AGC CGC CAT CTC TGC TAT G‑3'；CMV‑BIP：5'‑TTC GGT GAT GCG CGC TGA TAG TCT CGA GCG CAT CGT CT‑3'；CMV‑LF：5'‑AGT ACC GGT GAG GCT CCG TC‑3'；CMV‑LB：5'‑GGT GAC ATG AGA AAG TAC GCC GT‑3'。...
【技术特征摘要】
1.用于以RT-LAMP法快速检测香蕉重要病毒的引物，其特征在于：包括BBTV引物组、BSV引物组和CMV引物组，其中，BBTV引物组包括外引物对BBTV-F3和BBTV-B3，内引物对BBTV-FIP和BBTV-BIP，以及环引物对BBTV-LF和BBTV-LB；BSV引物组包括外引物对BSV-F3和BSV-B3，内引物对BSV-FIP和BSV-BIP，以及环引物对BSV-LF和BSV-LB；CMV引物组包括外引物对CMV-F3和CMV-B3，内引物对CMV-FIP和CMV-BIP，以及环引物对CMV-LF和CMV-LB，序列如下所示：BBTV-F3：5'-CTACTGATAAAACATTACCCAGAT-3'；BBTV-B3：5'-TCCCCACTACATACCAGTT-3'；BBTV-FIP：5'-CTCTTGATCATAGCCCAATGAAGTATGGAAAATGTTTATGCTTCTTGT-3'；BBTV-BIP：5'-TCTTGGGAAATCAACCAGCCGTAACCAGATGGCTATGTTCAG-3'；BBTV-LF：5'-CGGGCTTCACCTTGCAC-3'；BBTV-LB：5'-TCTGGAAGCCCCAGGTTTAT-3'；BSV-F3：5'-ATGCTAGGAGCTACATTCC-3'；BSV-B3：5'-TCCACTTACATACCCCTCC-3'；BSV-FIP：5'-CCAGTCCTGAGTATTCATTCTTCTTGAAACTGGGAAAAATCCTTGG-3'；BSV-BIP：5'-GAAGTTGTAGCTAATCTGCCAGAATCCATACAGCCATCCGTT-3'；BSV-LF：5'-GGACTCGTTTTGGCATACAGTG-3'；BSV-LB：5'-CTTGAGTTACCCCCCGAAAAAGC-3'；CMV-F3：5'-CGTAAAGTTCCTGCCTCCTC-3'；CMV-B3：5'-GGTGCTCGATGTCAACATGA-3'；CMVI-FIP：5'-GGCTTGAACTCCAGATGCAGCAGCCGCCATCTCTGCTATG-3'；CMV-BIP：5'-TTCGGTGATGCGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：张景欣，林壁润，沈会芳，蒲小明，孙大元，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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