本发明专利技术公开了一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶及其应用。本发明专利技术通过蛋白质工程技术对野生型甘露聚糖酶三维结构外层部位的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种获得对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶MAN47突变体。本发明专利技术所述的作用于甘露聚糖的突变体甘露聚糖酶(MAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N)，对胰蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.21倍，对胃蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.70倍，其他酶学性质较野生型酶有小幅度的提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及甘露聚糖酶，特别涉及到对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶。
技术介绍
β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖上β-1,4-糖苷键，促使其水解生成小的寡甘露糖的酶的总称,根据酶作用底物特异性和作用特点可以分为外切β-甘露聚糖酶和内切β-甘露聚糖酶两种类型。其中内切β-甘露聚糖酶是降解β-甘露聚糖的主要酶，它主要水解甘露聚糖和异甘露聚糖(半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖)中的β-1,4-D-甘露糖苷键，β-甘露聚糖酶对底物有严格的键专一性。β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物(海洋动物)、发芽植物的种子中(如番茄、咖啡豆、瓜儿豆、魔芋、四棱豆等)和微生物(包括细菌、真菌和放线菌)中都有所发现，其中微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料和石油等工业中有广泛的应用。考虑到动物摄食、营养和饲料加工等过程的特殊要求，饲用甘露聚糖酶需具备一定的特殊性：如：良好温度稳定性，能够经受高温制粒的加工后在常温下仍具有高酶活；广谱的pH稳定性，一般动物的消化道不同位置酸碱环境不同，pH值在2.5-6.8左右，因此饲用甘露聚糖酶需要在酸性的环境下稳定存在的同时还需要在酸性和中性的条件下维持较高活性。然而目前，饲料添加剂用酶的使用都是通过添加在饲料中一起喂食动物，经胃到达肠道，在肠道中发挥酶的作用。在这个过程中，饲用酶会受到动物肠道消r>化酶不同程度的破坏，而降低了使用效率，因此，提高饲料用酶对消化酶，如胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受性，可以延长其在动物体内消化道的使用寿命，对饲用酶的应用十分有价值。本专利技术利用酶促反应理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法，设计并筛选到了一株甘露聚糖酶突变体，所获得的甘露聚糖酶突变体对甘露聚糖催化降解功能不受影响，而对胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受提高了，该突变株对胰蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.21倍，对胃蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.70倍，命名为(MAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N)。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶。本专利技术是对甘露聚糖酶的基因(称为MAN47基因)进行定点突变。由假密环菌(Armillariellatabescens)EJLY2098中获得的甘露聚糖酶，已经被测序，GENBANK登录号为DQ286392。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。根据本专利技术所述的一种定点突变改造的甘露聚糖酶，是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的甘露聚糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶，所述的氨基酸取代是第121、123、153、157、346和347位的取代。根据本专利技术所述的定点突变改造的甘露聚糖酶的进一步特征，所述在第121位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代甲硫氨酸；在123位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代丝氨酸；在153位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代丝氨酸；在157位的氨基酸取代是用苏氨酸取代异亮氨酸；在346位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代丙氨酸；在第347位的氨基酸取代是用天冬酰胺取代谷氨酰胺；所述的定点突变改造的甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本专利技术所述的作用于甘露聚糖的突变体甘露聚糖酶(MAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N)，经人工肠液(pH7.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)处理3h后，其对胰蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.21倍，经人工肠液(pH2.0，1mg/mL胃蛋白酶溶液)处理2h后，其对胃蛋白酶的抗性比野生型MAN47提高1.70倍，其他酶学性质较野生型酶有小幅度提高。进一步地，本专利技术提供了一种DNA分子，其编码本专利技术所述的对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶。优选地，本专利技术所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DNA分子。本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者含有本专利技术所述的载体。上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。本专利技术还提供了本专利技术所述的对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶的生产方法，包括：在适于甘露聚糖酶表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的甘露聚糖酶。当本专利技术所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本专利技术优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。本专利技术优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本专利技术优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母甲醇诱导分泌表达。附图说明图1显示本专利技术所述的突变体与野生型MAN47蛋白在胰蛋白酶处理前和处理后的酶比活力。图2显示本专利技术所述的突变体与野生型MAN47蛋白在胃蛋白酶处理前和处理后的酶比活力。图3是本专利技术所述的突变体的酶活测定标准曲线。图4是SDS-PAGE蛋白电泳图，图4中，“→”处为目的蛋白条带，大小为45Kd左右；m MAN47为突变体m MAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N蛋白。图5是western blot图，图5中，目的蛋白条带大小为45Kd左右；m MAN47为突变体m MAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N蛋白。具体实施方式本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本专利技术中使用的一些特殊术语的定义。“wtMAN47”表示野生型甘露聚糖酶，其基因以斜体wtMAN47表示。“mMAN47M121F/T123N/S153F/I157T/G346F/Q347N”表示突变体甘露聚糖酶mMAN47M121F/T123N/S153F/I15本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的甘露聚糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第121、123、153、157、346和347位的取代。
【技术特征摘要】
1.一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶，其特征在于：它是由氨
基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的甘露聚
糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性更强的酶，所
述的氨基酸取代是第121、123、153、157、346和347位的取代。
2.根据权利要求1所述的对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的甘露聚糖酶，其特
征在于：所述在第121位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代甲硫氨酸；在123位的
氨基酸取代是用天冬酰胺取代丝氨酸；在153位的氨基酸取代是用苯丙氨酸取代
丝氨酸；在157位的氨基酸取代是用苏氨酸取代异亮氨酸；在346位的氨基酸取
代是用苯丙氨酸取代丙氨酸；在第347位的氨基酸取代...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，刘小芸，黎玉凤，谢春芳，刘大岭，刘桂祯，
申请(专利权)人：暨南大学，开平牵牛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。